细胞自噬检测参考.pdf

细胞自噬是生物学中一种重要的细胞自我调控机制，它涉及细胞内部蛋白质和细胞器的降解与回收。在正常条件下，细胞自噬活性较低，但通过特定的干预手段可以提高其活性以便进行研究。本文主要介绍了细胞自噬的检测方法和相关工具。 细胞自噬的诱导剂用于促进细胞自噬的发生。例如，Brefeldin A、Thapsigargin和Tunicamycin可以模拟内质网应激，Carbamazepine、L-690,330和Lithium Chloride通过抑制IMPase（肌醇单磷酸酶）来诱导自噬。Earle's平衡盐溶液通过饥饿作用触发自噬，N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）抑制Class I PI3K途径，Rapamycin则通过抑制mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）来诱导自噬。Xestospongin B/C作为IP3R（inositol 1,4,5-trisphosphate receptor）阻滞剂也可促进自噬。 另一方面，自噬抑制剂用于降低细胞的自噬水平。3-Methyladenine（3-MA）是一种Class III PI3K（磷脂酰肌醇3激酶）hVps34的抑制剂，Bafilomycin A1是质子泵抑制剂，而Hydroxychloroquine则是溶酶体腔碱化剂，这些都可用于阻止自噬过程。 在检测细胞自噬时，多种技术和策略被广泛应用。透射电镜可以直接观察到自噬体的形成，如Phagophore和自噬体（AV1）及自噬溶酶体（AV2）。此外，GFP-LC3融合蛋白是检测自噬形成的常用方法，GFP-LC3在自噬过程中形成明亮的荧光斑点，数量可以反映自噬活动的强度。Western Blot分析LC3-II/I比值变化也是评价自噬水平的有效方式，因为LC3-II的增加通常与自噬形成相关。检测长寿蛋白的降解、MDC染色和CellTrackerTM Green染色虽然提供了一些信息，但它们都是非特异性的方法。 自噬相关蛋白的定位是研究自噬机制的关键步骤。例如，Lamp-2可以标记溶酶体，LysoTrackerTM探针显示所有酸性液泡，而pDsRed2-mito和MitoTraker探针则分别用于检测线粒体的自噬程度。此外，Hsp60和Calreticulin分别用于线粒体基质和内质网的定位。在进行免疫荧光实验前，细胞通常需要进行透膜处理，例如用0.1%SDS处理。 细胞自噬的研究涵盖了从化学诱导、抑制到多种检测技术和自噬相关蛋白的定位。理解这些方法对于深入探索细胞自噬的生物学意义和潜在的医学应用具有重要意义。