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细胞自噬的研究方法
正常培养的细胞自噬活性很低, 不适于观察, 因此, 必须对自噬进行人工干预和调节,经报
道的工具药有:
一、自噬诱导剂
(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin :模拟内质网应激
(2) Carbamazepine/ L-690 ,330/ Lithium Chloride (氯化锂) :IMPase 抑制剂 (即 Inositol
monophosphatase ,肌醇单磷酸酶)
(3) Earle's 平衡盐溶液:制造饥饿
(4) N-Acetyl-D-sphingosine (C2-ceramide ): Class I PI3K Pathway 抑制剂
(5) Rapamycin :mTOR 抑制剂
(6) Xestospongin B/C :IP3R 阻滞剂
二、自噬抑制剂
(1) 3-Methyladenine (3-MA ):( Class III PI3K ) hVps34 抑制剂
(2) Bafilomycin A1 :质子泵抑制剂
(3) Hydroxychloroquine (羟氯喹): Lysosomal lumen alkalizer (溶酶体腔碱化剂)
除了选用上述工具药外, 一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预: 包括反义 RNA
干扰技术( Knockdown )、突变株筛选、外源基因导入等。
三、自噬过程进行观察和检测
细胞经诱导或抑制后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有:
1、观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。
Phagophore 的特征为:新月状或杯状, 双层或多层膜, 有包绕胞浆成分的趋势。 自噬体(AV1 )
的特征为:双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。自
噬溶酶体( AV2 )的特征为:单层膜,胞浆成分已降解。( autophagic vacuole ,AV )
2、在荧光显微镜下采用 GFP-LC3 融合蛋白来示踪自噬形成
由于电镜耗时长,不利于监测( Monitoring )自噬形成,人们利用 LC3 在自噬形成过程中发
生聚集的现象开发出了此技术。 无自噬时, GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中; 自噬形成时,
GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个
斑点相当于一个自噬体,可以通过计数来评价自噬活性的高低。
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