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13. DNA 连接酶的反应条件
① 连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。多数内切酶产生的粘性末端的 Tm 值在
15℃以下,然而保持连接酶活性的最佳反应温度却是 37℃,但在该温度下粘性末端之
间的氢键结合是不稳定的,因此最适温度是粘性末端的 Tm 值和连接酶最适温度的折中,
所以连接反应一般采用 16℃过夜
② DNA 浓度:外源片段浓度比载体 DNA 浓度高 10-20 倍 ;由于平末端的连接效率比粘性
末端要低得多,故在平末端连接反应中,T4 DNA 连接酶的浓度和外源 DNA 及载体 DNA
浓度均要求较高
③ 防止环化:碱性磷酸酶预先处理质粒载体
④ 时间:过夜最好
14. 平末端 DNA 片段的连接
直接用 T4 DNA 连接酶连接:效率不高,较少采用
同聚物连接平末端 DNA 片段:先用末端核苷酸转移酶,给平末端 DNA 分子加上同聚物
尾巴后再用 DNA 连接酶进行连接
用衔接物连接平末端 DNA 分子:目的是在平末端分子上构建限制性核酸内切酶酶切位
点,经酶切后产生特异的粘性末端,从而与具有互补末端的 DNA 连接(衔接物:指用
化学方法合成的一段由若干个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷
酸片段)
15. 重组 DNA 实验的一般程序
① 选用一种对载体 DNA 只具唯一限制识别位点的限制酶(如 EcoR I)作位点特异的切割,
形成全长的具粘性末端的线性 DNA 分子
② 再将外源 DNA 片段也用同一种酶作相同的消化
③ 混合,加入 DNA 连接酶。由于具有相同的(如 EcoR I)粘性末端,能退火形成双链结
合体。其中单链缺口经 DNA 连接酶封闭之后,便产生稳定的杂种 DNA 分子
16. 逆转录酶:亦称为反转录酶,是依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶,以 RNA 为模板指导三磷酸
脱氧核苷酸(dNTP)合成互补 DNA 链(cDNA)的酶。
17. 碱性磷酸酶
功能:催化去除 DNA、RNA、rNTP 和 dNTP 上的 5’端磷酸基团,以防发生自身连接
用途:在用 γ-P32 磷酸和多核苷酸激酶在 5’端标记 DNA 或 RNA 之前,进行碱性磷酸
酶处理;在 DNA 连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接
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