**Bac-to-Bac杆状病毒表达系统**是一种高效便捷的重组蛋白表达工具，尤其适用于在昆虫细胞中实现目的基因的高水平表达。该系统的核心原理是利用杆状病毒的Tn7转座子机制，将含有目的基因的pFastBac捐赠质粒插入到E. coli宿主DH10Bac的杆状病毒质粒上，从而产生重组杆状病毒。
**系统组成**：
1. **pFastBac捐赠质粒**：这是系统的基础，提供了插入目的基因的框架。根据不同的pFastBac菌体（Vector），可以选择不同的启动子（如PH、p10）来控制目的基因的表达。例如，pFastBacTM1有强启动子AcMNPV的PH，适用于高表达；pFastBacTMHT则带有6XHis标签，方便重组蛋白的纯化；而pFastBacTMDual可以同时表达两种蛋白质。
2. **E. coli宿主DH10Bac**：这种宿主细胞含有一份杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，具备微型-attTn7靶位点，能与pFastBac表达质粒发生转化反应，生成重组质粒。
3. **辅助质粒pMON712**：在DH10Bac中，辅助质粒提供转化蛋白，使Tn7转座子能在微型-attTn7位点准确插入，完成重组。
**工作流程**：
1. **克隆目的基因**：将目的基因克隆到pFastBac捐赠质粒，形成pFastBac表达质粒。
2. **转化DH10Bac**：将含有目的基因的pFastBac表达质粒转化至DH10Bac细胞，Tn7转座子会在微型-attTn7位点插入，生成重组质粒。
3. **重组杆状病毒生成**：将重组质粒DNA转染到昆虫细胞，生成重组杆状病毒。
4. **病毒滴定和表达**：扩增并滴定重组杆状病毒，然后用高滴度病毒株感染昆虫细胞，实现目的基因的高效表达。
**系统优势**：
- **时间效率**：与传统同源重组技术相比，Bac-to-Bac系统能更快地产生重组杆状病毒，通常在两周内即可完成，缩短了实验周期。
- **减少错误**：减少了斑点筛选过程中非重组病毒的误选概率，提高了实验准确性。
- **适合大规模操作**：适合同时处理大量重组，便于进行功能性蛋白的研究。
**注意事项**：
使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统需要一定的专业知识，包括杆状病毒生物学和昆虫细胞培养技术。操作者应熟悉病毒的培养、转染以及重组蛋白的检测和纯化方法。
**总结**：
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统通过简便快捷的Tn7转座子机制，使得在昆虫细胞中高效表达目的基因成为可能。这一系统包含了多种策略来优化目的基因的表达，如启动子选择、标签添加以及双基因表达等，为蛋白质功能研究和生物制药等领域提供了强大的工具。
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