流动相的选择技巧
常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈,甲醇有其性价比的优势,但是甲醇
活性高,可能与某些样品发生反应,而且甲醇在低波长下有紫外吸收,会降低分
析方法的灵敏度;乙腈虽然价格很高,毒性比甲醇大,但是洗脱能力比甲醇强,
很少与样品发生反应,用作流动相系统常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈,
甲醇有其性价比的优势,但是甲醇活性高,可能与某些样品发生反应,而且甲醇
在低波长下有紫外吸收,会降低分析方法的灵敏度;乙腈虽然价格很高,毒性比
甲醇大,但是洗脱能力比甲醇强,很少与样品发生反应,用作流动相系统压力要
比甲醇低很多,且截止波长比甲醇低 20nm,增加了检测出在低波长下才有吸收
的杂质的可能性,所以我们一般倾向于多用乙腈,少用甲醇。但是有时候样品峰
形不好或者分离不好,更换溶剂试试是一个很好的选择,毕竟不同的溶剂提供不
同的选择性。
对流动相的优化主要在水相上下功夫,水里可以加酸、加碱、加盐,从而改
善峰形、提高分离度。流动相里加碱的情况比较少,主要还是加酸,常用的酸有
磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等,其中最常用的是磷酸和三
氟乙酸,磷酸在低波长下没有紫外吸收,而三氟乙酸在低波长下有,但是三氟乙
酸易挥发而磷酸不行,所以单纯做液相,低波长下磷酸最合适,三氟乙酸有吸收,
运行梯度时基线漂移很严重,而做液质就要考虑首选三氟乙酸了,近些年还比较
流行加甲酸或乙酸。一般情况下这几种酸没有太大区别,我们更多的是考虑通过
加酸改变流动相的 pH 值,从而改善样品的分离度和峰形。
相同进样量样品峰越高则意味着峰形越好,从图中可以看出多数样品在低
pH 值下峰形都比中性要好,这个主要是由色谱柱本身的性质所决定的。色谱柱
主要都是硅胶基质,现有的填料处理工艺无法将硅胶上残余的硅羟基全部去除,
硅羟基会造成样品峰拖尾,一般认为硅羟基的 pKa 在 3.5 到 4.5 之间,低 pH 值
能帮助抑制硅羟基的活性,减小拖尾,从而改善峰形,提高分离度。水溶液中添
加 0.1%(体积)的磷酸或者三氟乙酸其 pH 值大概在 2 左右,用作流动相正好抑制
硅羟基的活性,所以开发液相分析方法时流动相首选水加 01.%的磷酸,然后再
以此为基础做优化。
在单独用酸不行的时候就要考虑使用缓冲盐,缓冲盐的选择原则是:简单、
稳定、缓冲能力强、配制简单,需要调 pH 值时要有相应的酸或碱。常用的缓冲
盐是磷酸盐,主要是钾盐和钠盐,再有就是醋酸盐,常用的盐浓度在 10~20mM
左右。以前因为色谱柱填料生产工艺的问题,往往需要在流动相里添加三乙胺来
减少拖尾,但是三乙胺对色谱柱的寿命有很大影响,现在新的色谱柱都不再需要
了。流动相里有时会需要调节 pH 值到碱性,具体 pH 要视色谱柱的耐受范围而定,
常用 NaOH、KOH 溶液或氨水做为调节缓冲盐溶液碱性 pH 的试剂,也可以往水里
单独添加氨水做碱性流动相。
在缓冲盐做流动相时,出峰太早、峰形很差、相似结构的化合物峰因为拖尾
或峰型太宽而不能达到基线分离时,可以考虑使用离子对试剂,常用的离子对试
剂主要是各种烷基磺酸钠和四丁基铵盐,但是流动相里使用离子对试剂时,系统