流动相的选择是液相色谱法中至关重要的步骤，对于实验结果的准确性和安全性有着直接影响。在反相液相色谱中，甲醇和乙腈是最常用的流动相溶剂。甲醇具有较高的性价比，但其活性较高，可能会与某些样品发生化学反应，同时在低波长下有紫外吸收，这可能导致分析方法灵敏度下降。相比之下，乙腈虽然价格较高且毒性较大，但它的洗脱能力更强，与样品发生反应的可能性较小，且在低波长下的截止波长大于甲醇，有利于检测低波长吸收的杂质。
流动相的优化通常集中在水相的调整，可以通过添加酸、碱或盐来改善峰形和提高分离度。常用的酸包括磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸和甲基磺酸，其中磷酸由于在低波长下无紫外吸收，常用于纯液相分析；而三氟乙酸虽有紫外吸收但易于挥发，适用于液质联用。加酸的主要目的是调整流动相的pH值，以优化样品的峰形和分离度。通常，较低的pH值有助于抑制硅羟基的活性，减少峰拖尾，从而改善峰形和提高分离度。
当单一酸的调整不足以满足需求时，可以引入缓冲盐，如磷酸盐（钾盐或钠盐）和醋酸盐，浓度通常在10-20mM。过去，由于色谱柱填料工艺的限制，可能需要添加三乙胺来减少拖尾，但现在的新色谱柱已不再需要。在需要碱性流动相时，可以选择NaOH、KOH溶液或氨水来调节pH值。
在某些情况下，如峰形差、相似结构化合物无法基线分离时，可以使用离子对试剂，如烷基磺酸钠和四丁基铵盐。然而，离子对试剂可能导致系统平衡时间长、样品保留时间不稳定，以及基线背景吸收问题，因此应谨慎使用。
在流动相中使用缓冲盐时，需注意盐析出和基线漂移问题，尤其是醋酸铵可能导致低波长下的基线严重下降。为解决这个问题，可以预先在乙腈中加入10%的水，并在水中添加10倍水溶液浓度的缓冲盐，以保持梯度中A、B两相的盐浓度一致，减轻基线漂移。
对于复杂分子结构的原料药分析，可能需要尝试不同pH值的磷酸盐缓冲溶液，如pH 2和6.5，以找到最佳的流动相条件。而对于中间体或IPC的分析，可以基于经验简化这一过程。
在选择分析方法时，首先要明确目标，了解所需的仪器和试剂，然后根据样品特性和实验目的进行流动相和色谱柱的优化选择。色谱柱的选择是关键，需要考虑新柱子、新技术和使用方法，以便获取最佳的分离效果。在实际操作中，可以参考专业文献和资源，如Ron Majors的“色谱柱观察”专栏，以获取最新的色谱分析信息和技术。
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