【实验四 植物组织总DNA的提取、扩增及电泳检测】
在作物学研究中,了解和掌握DNA的提取、扩增以及检测技术是至关重要的。本实验主要涉及的是从植物组织中提取基因组DNA,使用CTAB法进行,接着进行PCR扩增,最后通过电泳检测DNA的质量和纯度。以下将详细阐述这些过程。
**一、CTAB法提取植物总DNA**
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂,它能破坏细胞膜和核膜,使DNA得以释放。在高盐浓度(如0.7mol/L NaCl)下,DNA与CTAB形成的复合物是可溶的。通过添加有机溶剂(如氯仿)进行抽提,可以去除蛋白质、多糖和酚类等杂质,然后利用乙醇沉淀DNA。CTAB溶液在低温下会沉淀,因此在使用前需预热并保持操作温度在15℃以上。
**二、实验原理**
1. **2×CTAB提取缓冲液**:包括Tris-HCl(pH8.0)、EDTA(pH8.0)、NaCl和2%(W/V)的CTAB。Tris-HCl提供缓冲环境,保护DNA不被破坏;EDTA螯合金属离子以抑制DNase活性;NaCl提供高盐环境,使DNA溶解;CTAB用于溶解细胞膜并结合DNA。
2. **植物组织处理**:使用机械研磨,如在液氮中研磨,可以快速破碎植物组织并减少酶的活性,从而减少DNA降解。
3. **抽提过程**:加入氯仿,使得蛋白质变性并形成两相,DNA留在水相中。通过离心,进一步去除杂质。上清液加入异丙醇沉淀DNA,最终用双蒸水或TE缓冲液溶解DNA。
**三、实验材料和器具**
实验所需的材料包括幼嫩的水稻幼苗,器具包括微量移液器、台式离心机、60℃水浴锅、枪头、离心管等。试剂有2×CTAB抽提溶液、氯仿、异丙醇、70%乙醇、双蒸水等。
**四、实验步骤**
1. 将水稻幼苗研磨成粉末,加入750μl 2XCTAB抽提液,60℃水浴30分钟。
2. 加入等体积的氯仿,振荡后离心,取上清液。
3. 上清液中加入异丙醇,静置沉淀DNA。
4. 使用70%乙醇洗涤DNA沉淀,37℃烘箱干燥。
5. 溶解DNA于ddH2O中。
6. 用电泳检测DNA。
**五、注意事项**
- 叶片研磨要精细,操作迅速以减少DNA酶的活性。
- 移液器的使用需规范,避免对设备造成损害。
**六、移液器操作要点**
1. 设定移液体积时,从大体积到小体积逆时针调节,从小体积到大体积时可先顺时针过量,再回调。
2. 装配吸头时轻轻转动,避免撞击。
3. 吸液和放液要控制速度,吸液深度约3mm,放液时吸头贴容器壁。
**七、吸液技巧**
- 正向吸液适用于常规液体,反向吸液适用于粘稠或易挥发液体,结合预润湿吸头可以提高效率。
本实验旨在让学生掌握从植物组织中提取DNA的基本技能,理解DNA提取的原理,以及后续的DNA扩增和电泳检测,这些是分子生物学实验的基础,对于作物遗传学研究和改良具有重要意义。通过实践,学生将能更好地理解和应用这些技术。