【实验四 植物组织总DNA的提取、扩增及电泳检测】
在作物学研究中，了解和掌握DNA的提取、扩增以及检测技术是至关重要的。本实验主要涉及的是从植物组织中提取基因组DNA，使用CTAB法进行，接着进行PCR扩增，最后通过电泳检测DNA的质量和纯度。以下将详细阐述这些过程。
**一、CTAB法提取植物总DNA**
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，它能破坏细胞膜和核膜，使DNA得以释放。在高盐浓度（如0.7mol/L NaCl）下，DNA与CTAB形成的复合物是可溶的。通过添加有机溶剂（如氯仿）进行抽提，可以去除蛋白质、多糖和酚类等杂质，然后利用乙醇沉淀DNA。CTAB溶液在低温下会沉淀，因此在使用前需预热并保持操作温度在15℃以上。
**二、实验原理**
1. **2×CTAB提取缓冲液**：包括Tris-HCl（pH8.0）、EDTA（pH8.0）、NaCl和2%（W/V）的CTAB。Tris-HCl提供缓冲环境，保护DNA不被破坏；EDTA螯合金属离子以抑制DNase活性；NaCl提供高盐环境，使DNA溶解；CTAB用于溶解细胞膜并结合DNA。
2. **植物组织处理**：使用机械研磨，如在液氮中研磨，可以快速破碎植物组织并减少酶的活性，从而减少DNA降解。
3. **抽提过程**：加入氯仿，使得蛋白质变性并形成两相，DNA留在水相中。通过离心，进一步去除杂质。上清液加入异丙醇沉淀DNA，最终用双蒸水或TE缓冲液溶解DNA。
**三、实验材料和器具**
实验所需的材料包括幼嫩的水稻幼苗，器具包括微量移液器、台式离心机、60℃水浴锅、枪头、离心管等。试剂有2×CTAB抽提溶液、氯仿、异丙醇、70%乙醇、双蒸水等。
**四、实验步骤**
1. 将水稻幼苗研磨成粉末，加入750μl 2XCTAB抽提液，60℃水浴30分钟。
2. 加入等体积的氯仿，振荡后离心，取上清液。
3. 上清液中加入异丙醇，静置沉淀DNA。
4. 使用70%乙醇洗涤DNA沉淀，37℃烘箱干燥。
5. 溶解DNA于ddH2O中。
6. 用电泳检测DNA。
**五、注意事项**
- 叶片研磨要精细，操作迅速以减少DNA酶的活性。
- 移液器的使用需规范，避免对设备造成损害。
**六、移液器操作要点**
1. 设定移液体积时，从大体积到小体积逆时针调节，从小体积到大体积时可先顺时针过量，再回调。
2. 装配吸头时轻轻转动，避免撞击。
3. 吸液和放液要控制速度，吸液深度约3mm，放液时吸头贴容器壁。
**七、吸液技巧**
- 正向吸液适用于常规液体，反向吸液适用于粘稠或易挥发液体，结合预润湿吸头可以提高效率。
本实验旨在让学生掌握从植物组织中提取DNA的基本技能，理解DNA提取的原理，以及后续的DNA扩增和电泳检测，这些是分子生物学实验的基础，对于作物遗传学研究和改良具有重要意义。通过实践，学生将能更好地理解和应用这些技术。
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