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纳秒脉冲电场诱导B16细胞凋亡的机制研究.docx
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纳秒脉冲电场诱导B16细胞凋亡的机制研究.docx
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电峰值电场强度从 10~300 kV/cm 的纳秒脉冲电场可以单独应用于肿瘤消融研究
[1]
。
由于脉冲宽度低于细胞膜的充电周期,纳秒脉冲电场可以与细胞内的细胞器相互作用。通
过选择合适的脉冲参数,纳秒脉冲可以触发肿瘤细胞凋亡,进而诱导特异性免疫,不仅可
以进行局部肿瘤消融,而且可以有效防治肿瘤转移和复发
[2-5]
。纳秒脉冲电场的凋亡机制研
究包括电场作用靶点和信号通路,电场作用靶点的探究有助于优化出最佳的脉冲参数以获
得最佳的治疗效果
[6-7]
,而信号通路的研究为增强/抑制特定的分子开发新的治疗方案。文献
[8-11]分别说明了纳秒脉冲诱导肿瘤凋亡涉及 p53 凋亡通路、TGF-b1 通路、PI3K/AKT 通
路、和 NF-κB 通路等。然而由于纳秒脉冲诱导肿瘤凋亡涉及的靶点较多,也受传统研究方
法的限制,纳秒脉冲诱导肿瘤凋亡的凋亡机制尚未得到充分研究。
蛋白芯片是在载体表面有序排列的大量蛋白抗体,相较于酶联免疫吸附试验(ELISA)
和免疫印迹实验(WB)这种只能检测单种蛋白的技术,蛋白芯片可以同时检测多个蛋白。低
密度蛋白芯片可以同时观测多个目标蛋白,而高密度蛋白芯片可以同时观测数以百计的蛋
白质
[12]
。此外,蛋白芯片不仅可以快速筛选关键蛋白,还可以通过富集分析来发现它们之
间的相关关系和未发现的机制。富集分析是一种针对高通量组学数据的分析手段,该分析
手段基于基因集,而不是单个基因,可以快速分析基因表达
[13]
。纳秒脉冲诱导肿瘤凋亡的
作用机制复杂,而且涉及多个靶点,因此抗体阵列和高通量蛋白组学富集分析是本研究以
及类似的多靶点机制研究的高效研究方案。
本研究首先通过基于流式细胞荧光分选技术的凋亡实验,观察在脉冲电场作用小鼠黑
色素瘤 B16 细胞后不同孵育时间的凋亡率,从而间接观察脉冲电场作用细胞后的细胞凋亡
过程。然后,通过蛋白芯片实验显示脉冲电场作用 B16 细胞后不同蛋白的差异表达,并根
据 GO 功能富集分析和 KEGG 通路富集分析,分析出纳秒脉冲诱导治疗的生物学过程、分
子生物学过程和相关的 KEGG 通路。纳秒脉冲电场刺激小鼠黑色素瘤 B16 细胞的凋亡通路
分 3 个步骤,而且涉及多个信号通路,如 PI3K/AKT 通路、NF-κB 通路、TGF-b1 细胞凋亡
通路、肿瘤坏死因子通路和 p53 凋亡通路。基于蛋白芯片技术与富集分析的实验方案在多
靶点机制研究中具有独特的优势,这些实验结果为设计未来的纳秒脉冲诱导治疗方案提供
了参考,优化最佳的脉冲参数或增强/抑制特定的分子以获得最佳治疗效果。
1. 实验方案
1.1 细胞株的培养
小鼠黑色素瘤 B16 细胞株购自 Procell 生物科技有限公司,购买后一直使用液氮冷冻
保存至实验前。复苏时在 37 ℃的热水浴中进行解冻,然后转移到 RPMI-1640 的培养基
中。RPMI-1640 培养基中加入 10%的胎牛血清(FBS)和 2%的青霉素−链霉素溶液。培养瓶
被置于 37 °C、5% CO
2
、95%空气的培养箱中培养。
1.2 纳秒脉冲的施加方案
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