实验二十二动物寄生虫病的Dot-ELISA法诊断技术.doc

Dot-ELISA法诊断技术 Dot-ELISA测定法是基于常规ELISA方法的基础上发展起来的新技术。该方法使用硝酸纤维膜（NC膜）作为固相载体，具有更好的吸附能力和更高的敏感性。该方法可以用于检测各种寄生虫病的抗原或抗体，例如弓形虫病、包虫病、囊虫病、捻转血矛线虫病、血吸虫病、华枝睾吸虫病、旋毛虫病等。 Dot-ELISA测定法的原理是将待检样本点在NC膜上，形成固相抗原或抗体，然后加入酶标记的抗体，形成抗原-酶标抗体复合物。加入底物，使复合物上的酶催化底物而显色。根据显色反应的有无或颜色深浅，可以进行定性或半定量的检测。 Dot-ELISA测定法具有特异性强、假阳性少、敏感性高、试剂用量少、操作简便、结果可长期保存等优点。该方法简易快速、便于推广，已经广泛应用于多种寄生虫病的诊断和监测。 实验目的及要求: 1. 了解Dot-ELISA法的原理和基本操作过程。 实验器材: 1. 硝酸纤维膜（NC膜）或聚氯乙烯（PVC）白色薄膜凹孔板 2. 微量加样器 3. 滤纸 4. 玻璃皿 5. 0.01mol/L PBS（pH7.4） 6. Tris缓冲液 7. 封闭液（2%BSA的0.01mol/L PBS） 8. PBS-T洗涤液 9. 底物溶液（二氨基联苯胺） 10. 酶标抗体 实验方法、步骤和操作要领: （一）直接法测抗原（以检测血吸虫循环抗原为例） 1. 将待检血清点在NC膜上 2. 将NC膜浸入封闭液中振摇封闭 3. 将NC膜浸入洗涤液中振荡洗涤 4. 将NC膜浸入单克隆酶标抗体溶液中 5. 将NC膜浸入底物溶液中振摇显色 6. 用流水冲洗数分钟，放入蒸馏水中终止反应 （二）间接法测抗体（以检测旋毛虫病抗体为例） 1. 将特异性抗原点在NC膜上 2. 将待检血清加入，形成抗原-抗体复合物 3. 将酶标记的抗抗体加入，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物 4. 将NC膜浸入底物溶液中振摇显色 5. 用流水冲洗数分钟，放入蒸馏水中终止反应 判定标准: 根据显色反应的有无或颜色深浅，可以进行定性或半定量的检测。斑点呈深褐红色为+++, 褐红色为+++, 浅褐红色为+, 无色为阴性。 Dot-ELISA测定法的优点: 1. 特异性强 2. 假阳性少 3. 敏感性高 4. 试剂用量少 5. 操作简便 6. 结果可长期保存 7. 可用于检测多种寄生虫病的抗原或抗体 Dot-ELISA测定法的应用前景广阔，已经广泛应用于多种寄生虫病的诊断和监测。该方法简易快速、便于推广，具有广阔的应用前景。