荧光定量PCR内参基因的筛选及杜梨HKT基因的克隆和功能鉴定-张秋悦.pdf
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2023-11-05
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2x3x4=24个叶片
荧光透射仪、凝胶成像仪
（E）=-3.22=10（-1/斜率）-1
还有其他pcr么？
如何载体连接？
荧光定量PCR内参基因的筛选及杜
梨HKT基因的克隆和功能鉴定-张
秋悦
内参基因
的筛选
HKT 克隆、
序列分析和
功能研究
RNA提取和
cDNA合成
引物设计
和扩增
引物特异
性分析
RNA试剂盒提
取（天根）
RNA转录
组测序
cDNA为模板-10对引物普通PCR扩增（定性）-1%琼脂糖电泳-检测扩增产物（仅仅定性）
-回收目的片段
引物扩增效率的计算
内参引物特异性检测
数据分析
HKT表达量分析
浓度和纯度-微量分光光度计-Nanodrop 2000/2000C
RIN生物分析仪完整度-1%琼
脂糖电泳-3/2个条带
测序（诺禾致源）-建库
参考基因组（https://bigd.big.ac.cn/gwh/Assembly/647/show）
/UCSC基因组浏览器数据库(http://genome.ucsc.edu/index.html)
序列拼接-FPKM计算基因表达量（TPM、RPKM)
基因注释 NR、pfam、swissprot 等数据库注释/gencode数据库（
http://www.gencodegenes.org/)下载基因组注释文件
基因组浏览器IGV， Integrative Genomics Viewer（
http://software.broadinstitute.org/software/igv/download）-加载基
因组和注释文件-排序
cDNA 反转录试剂盒合成cDNA（天根）
FPKM 数据-计算每个基因变异系数-变异系数小的基因才能做内参稳定（
100-200bp）且文献中已有内参基因和转录组注释信息-FPKM>30的有
3379个8个候选内参基因-10个-对照是啥意思？
Primer 3 在线软件设计荧光定量特异引物20bp--合成11对引
物（金斯瑞）-目的基因HKT的引物
pEasy-T1 载体连接-测序（上海生工）-NCBI Blast测序对比-97%-100%匹配的质粒
测定载体的质量分数（紫外分光光度计）-计算载体拷贝数-以含有目的基因的载体作为模板
质粒--荧光定量PCR(天根）-检测ABI StepOnePlus-熔解曲
线Ct值-绝对定量-标曲-R2>0.99-扩增效率（E）
引物扩增稳定性评估-delta CT、BestKeeper、geNorm、NormFinder、
对以上四种方法综合评价-RefFinder
2个稳定内参-计算相对表达量-2^(-∆∆CT)方
植物叶片 DNA 粗提取
杜梨总 RNA 的提取
PCR 产物扩增及其纯化回收
克隆载体的连接与感受态细胞的转化
菌落 PCR 与质粒 DNA 的提取、测序
HKT 基
因生物信
息学分析
HKT 基因表达载体
的构建与遗传转化
农杆菌转化
拟南芥侵染
HKT 基因功能验证
种子萌发实验
拟南芥植株盐胁迫的生理指标测定
试剂盒（天根）
试剂盒（天根）-测定浓度和纯度（分光光度计）-完整性（1%琼脂糖电泳）
HKT 基因的克隆（RACE-PCR赛默飞）-1%琼脂糖电泳（紫外照射切割）-DNA回收试剂盒（天根）
与 p Easy-T1 载体连接 Trans1-T1 感受态细胞
开放阅读框分析（ORF) NCBI 的 ORF Finder 在线软件进行（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）
NCBI Blast 功能比对
各物种HKT的蛋白序列整 合（NVBI、TAIR） 分 析 与 构 建 进 化 树（MEGA7.0）
对杜梨 HKT 基因编码蛋
白的保守结构域进行分析
NCBI CD-search 在线软件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）
预测杜梨 HKT 基因
编码的蛋白信号肽
Signal P4.0 在线软件（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?Signal P-4.0）
分析 HKT 基因编码
蛋白的理化性质
在线软件 Prot Param 系列（https://web.expasy.org/protparam/）
分析 HKT基因编码
蛋白的跨膜结构
Deep TMHMM 在线软件（https://dtu.biolib.com/Deep TMHMM）
分析 HKT 基因编码
蛋白的二级结构
在线软件 GOR Ⅳ（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）
单个菌落 HKT 扩增引物进行 PCR 验证 提取质粒，收集重组质粒（天根） 质粒测序（上海生工）
p Easy-T1载体与 p CAMBIA1305 载体进行双酶切 1%琼脂糖凝胶电泳并分离酶切产物 HKT 基因片段和酶切后p CAMBIA1305 载体条带
试剂盒（全式金）回收并纯化回收片段
比较所有物种的 HKT 蛋白结构域 Motif（https://www.genome.jp/tools-bin/search_motif_lib）
载体片段连接 大肠杆菌感受态细胞转化 培养
单菌落菌液 PCR 验证-筛选阳性菌落-提取质粒-测序（生工） 质粒扩大培养-农杆菌转化
农杆菌单菌落，进行菌液 PCR 验证
问题
短read-组装成参考基因组-序
列mapping回帖？就是比对
OD260/OD280在1.8-2.2之间，
OD260/OD230≥2，28S/18S≥1，动物样品
RIN≥7.0，植物样品RIN≥6.5，RNA无明显降解
。
转录组-rna浓度和完整性，电泳wb和pcr需要测么？加样，都测，转录组测完整度
基因组为啥注释，如何
注释，文件格式？为啥
计算基因表达量差异？
差异基因筛选
结构注释：IGV
功能注释
无参考基因组：Trinity转录本组装，SOAPdenovo-Trans快但是差
参考基因组CDS：程序Trinotate、eggnog-mapper等，在线版本
有EggNOG Database。单纯的GO注释可用AHRD，KEGG可用
KAAS
用Browser Extensible Data (BED) 或者 General Feature
Format (GFF)文件格式表示，用UCSC Genome Browser进行可
视化比较
基因组的说明书，告诉我们哪些序列是编码蛋白的基因，
哪些是非编码基因，外显子、内含子、UTR等的位置等等
Nr/Nt、GO、Kegg、UniProt （Swiss-Prot 和 TrEMBL）、COG
直系同源蛋白、KOG数据库（真核生物蛋白相邻类的聚簇）、
EggNOG是直源同系蛋白分组比对、Pfam是蛋白质家族、STRING
数据库（https://string-db.org/）是一个搜寻已知蛋白质之间和预
测蛋白质之间相互作用关系的系统
string Tie：拼接、注释比对、补充信息
测序结果
row counts ：差异基因的筛选
fpkm：表达矩阵，热图或基因表达变化的比较
内参基因引物啥意思？pcr的流程和原理
片段化和酶切一样么？正好对上基因编号
24叶片做cDNA模版，进行q-pcr
为啥要构建载体？，提质粒，测序
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