基因工程的酶学基础主要涉及的是在分子生物学领域中，如何利用特定的酶来操作和改造DNA分子。其中，限制性核酸内切酶（restriction endonucleases）扮演了核心角色，它们是生物体内的防御机制，能识别并切割外来DNA，防止外源遗传物质的干扰或病毒的感染。这些酶的发现对基因工程的发展产生了深远影响。
限制性内切酶，又称限制酶，可以识别DNA分子中的特定核苷酸序列，并在此处切割DNA双链。这个识别序列通常是短的回文序列，如EcoRI的“GAATTC”。根据酶的性质和功能，它们被分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅱ型限制酶是最常用于基因工程的，因为它们切割DNA后常常产生具有互补末端的粘性末端，这有利于DNA片段的拼接和重组。
Ⅱ型酶的特征包括：
1. 特异性识别并切割DNA分子上的回文序列。
2. 切割点位于识别序列内部，产生粘性末端，便于DNA片段的连接。
3. 需要Mg++作为辅助因子进行切割反应。
4. 形成的粘性末端可以是3'端带有OH基团或5'端带有OH基团的，如Pst1和EcoR1。
限制性内切酶的工作原理与宿主的R/M（限制与修饰）体系密切相关。细菌通过甲基转移酶修饰自身的DNA，使其免受限制酶的切割。例如，E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶，甲基化酶可以防止EcoB核酸酶切割自身DNA，而对外来DNA进行降解，形成细胞的防御屏障。
在基因工程中，科学家利用限制酶来切割目标DNA，产生可以与载体DNA结合的末端。这些切割和连接过程是克隆DNA的基本步骤。例如，通过同裂酶（识别并切割相同序列的不同酶，如HpaⅡ和MspⅠ）和同尾酶（产生相同粘性末端但识别不同序列的酶）的使用，可以提供更多的灵活性和选择性，以适应不同的实验需求。
此外，平末端是指限制酶切割DNA后形成的末端没有互补配对，这样的末端不容易自发连接，通常需要DNA聚合酶参与修复和连接。DNA连接酶则负责将具有相同或互补末端的DNA片段连接起来，形成新的DNA分子，这是构建重组DNA和克隆的关键步骤。
基因工程的酶学基础是现代生物学和医学研究的重要组成部分，它使得我们能够精确地操作基因，实现基因的插入、删除和替换，从而推动了遗传疾病治疗、药物研发和生物技术的进步。
