甲基化分析流程及代码实现

在生物信息学领域，甲基化是DNA分子中一个重要的表观遗传修饰，它涉及到一个甲基基团（-CH3）添加到DNA的胞嘧啶（C）碱基上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。这个过程可以影响基因表达，不改变DNA序列本身，但能调控基因的活性，参与多种生物学过程，如细胞分化、发育和疾病的发生。本文将详细介绍基于R语言的甲基化数据分析流程，并提供相关的代码示例。 1. 数据获取与预处理： - **原始数据格式**：常见的甲基化测序数据格式有Bisulfite Sequencing (BS-seq) 和 Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS)。这些数据通常以BED、BAM或WIG格式提供。 - **读取数据**：使用`Rsamtools`包读取BAM文件，`bedGraphToBigWig`工具转换BED或WIG格式数据为便于分析的大 Wiggle (bigWig) 文件。 - **质量控制**：通过`fastQC`和`trimGalore`等工具对原始测序数据进行质量检查和修剪。 2. 甲基化位点识别： - **比对**：使用比对软件如`Bismark`将测序读取比对到参考基因组。 - **甲基化状态计算**：`Bismark`能自动统计5mC的频率，生成BED或TXT格式的甲基化位点文件。 3. 甲基化差异分析： - **甲基化水平计算**：`methylKit`包可以用于计算每个位点的甲基化百分比。 - **差异甲基化位点(DMS)检测**：使用`methylKit`的`findDMS`函数，设定阈值比较不同样本间的甲基化差异。 - **差异甲基化区域(DMR)分析**：`methylKit`或`bumphunter`包可以检测连续区域的显著甲基化差异。 4. 功能注释与富集分析： - **注释功能**：将DMS或DMR与基因、转录因子结合位点、 CpG岛等进行注释，可以使用`annoateMethylation`函数（`methylKit`）。 - **富集分析**：通过`enrichr`或`goseq`等工具进行GO富集分析，了解甲基化变化与特定生物学过程的关系。 5. 可视化： - **热图**：`ComplexHeatmap`包可创建甲基化位点的热图，展示不同样本间的甲基化差异。 - **火山图**：用`ggplot2`绘制DMS的火山图，直观显示显著差异位点。 - **轨迹图**：通过`methylationPCA`函数（`methylKit`）进行主成分分析，展示样本间甲基化状态的差异。 6. 结果验证与下游分析： - **实验验证**：通过靶向甲基化PCR或bisulfite sequencing验证DMS结果。 - **基因表达关联分析**：利用RNA-seq数据探究甲基化状态与基因表达的关系，如`edgeR`或`DESeq2`进行差异表达分析。 以上流程提供了甲基化数据分析的基本框架，实际操作中需根据具体研究目的和数据类型进行调整。在使用R进行甲基化分析时，确保熟悉相关包的使用方法，并结合文献和最佳实践进行分析。提供的"甲基化分析流程.pdf"文件可能包含了更详细的步骤和代码实例，建议仔细阅读以深入理解这一过程。