小鼠BPI36-259抗菌蛋白在原核细胞中的表达及其抗血清的制备资源-CSDN文库

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小鼠 BPI N 端功能基因片段的克隆及其表达产物在胞

内杀菌作用的研究

李丽，冯颖，吕喆，孔庆利，刘振龙，赵冬，高燕，王炜，安云庆

首都医科大学免疫学系，北京（100069）

E-mail: doctor_lily1982@yahoo.cn

摘要：目的：克隆小鼠 BPI

36-259

基因片段，转染细胞获得具有杀菌作用的目的抗菌蛋白。

方法：采用生物信息学方法，构建PUC57-muBPI

1-281

质粒；PCR扩增获得muBPI

36-259

基因片

段，制备pcDNA3.1 (+)-muBPI

36-259

重组质粒；采用电穿孔法将上述重组质粒转染RAW264.7

细胞，Western-blot法检测目的蛋白在胞内的表达；建立胞内杀菌实验模型，检测muBPI

36-259

目的蛋白对胞内寄生菌（伤寒杆菌）的杀伤作用。结果：muBPI

36-259

目的蛋白在RAW264.7

细胞内成功表达，对胞内寄生菌—G

伤寒杆菌具有杀伤作用。结论：成功克隆了小鼠BPI

36-259

基因片段，转染RAW264.7细胞获得具有生物学活性目的抗菌蛋白。

关键词：杀菌/渗透性增强蛋白；RAW264.7细胞；伤寒杆菌

中国图书分类号：R392

杀菌/渗透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein，BPI)是广泛存在于人、

牛、猪等多种哺乳动物多形核中性粒细胞中的一种 55KD 的阳离子抗菌蛋白

(1,2)

。因其兼备

中和内毒素和杀伤革兰氏阴性菌(GNB)双重作用而受到关注

(3)

。我们成功克隆了人 BPI 基因

和人 IgGFc 基因，制备了 AAV2-BPI-Fcγ1 重组病毒，将其转染小鼠两周后，可使小鼠对致

死量 E.coli 感染攻击产生良好的保护作用

(4,5)

。人 BPI 和 Fcγ1 为异源性蛋白，可引发小鼠免

疫应答产生相应抗体阻断目的抗菌蛋白的杀菌作用。因此，无法长期观察基因导入小鼠对

GNB 感染的抵抗作用，难以确定抗感染基因转染能否为临床感染高危人群提供一种有效预

防 GNB 感染的方法和途径。

为此，本研究拟克隆编码小鼠 BPI 功能片段的基因（muBPI

36-259

）和编码小鼠 IgGFc 基

因（Fcγ），制备 AAV2-muBPI

36-259

-Fcγ1 重组病毒载体，并通过观察目的基因产物在小鼠体

内能否引起免疫应答和基因转染小鼠对致死量 E.coli 感染攻击保护作用持续的时间，以确定

人 BPI-Fcγ1 嵌合基因转染在临床感染高危人群中应用的可行性。

采用生物信息学方法对小鼠 BPI 和人 BPI 基因进行同源分析，预测小鼠 BPI 功能片段，

获得 muBPI

36-259

基因片段，构建 pcDNA3.1 (+)-muBPI

36-259

重组质粒。然后采用电穿孔法将

上述重组质粒转染 RAW264.7 巨噬细胞，通过胞内杀菌试验

(6)

检测目的抗菌蛋白的杀菌活性。

1. 材料与方法

1.1 材料

BamHΙ、KpnΙ 限制性内切酶，T4 DNA 连接酶，Go Taq polymerase 购自 Promega 公司；

Qiagen 胶纯化回收试剂盒，购自北京欣经科生物技术有限公司；Tiangen 质粒小提试剂盒，

购自天根生化科技北京有限公司；威格拉斯大提质粒试剂盒购自威格拉斯生物技术北京有限

公司；伤寒杆菌（50071）为本室保存；RAW264.7 细胞为小鼠单核／巨噬细胞系（ATCC®

Number：CRL-2278™），购自中国协和医科大学细胞中心；绿色荧光增强蛋白表达质粒

pEGFPN1 为本室保存；pcDNA3.1 (+)质粒购自 Invitrogen 公司；兔抗鼠 BPI 多克隆抗体为本

本课题得到教育部博士学科点专项科研基金（20040025002）和北京市自然科学基金项目（7082016）的资

助。

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室制备、羊抗兔 IgG 单克隆抗体购自华美生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠 BPI 功能片段的预测

采用 ClustalW 软件对 BALB/c 小鼠和人 BPI 氨基酸序列进行比对，结果显示小鼠 BPI

氨基酸序列与人 BPI 氨基酸序列 53%相同，相似度高达 71％（图略）。采用 SMART 软件预

测分析 BALB/c 小鼠 BPI 氨基酸结构域，发现小鼠与人 BPI 结构域高度相似，其 N 端第 1～

27 位氨基酸为信号肽序列，N 端第 36～259 位氨基酸是具有中和内毒素和杀菌作用的功能

片段，C 端第 274～478 位氨基酸序列与 N 端结构域氨基酸序列相似度小于 20%（表略）。

由上海生工生物工程技术服务有限公司化学合成小鼠 BPI

1-281

基因片段，构建 PUC57-BPI

1-281

质粒。

1.2.2 小鼠 BPI36-259 目的基因片段的扩增

以 PUC57-BPI

1-281

质粒 DNA 为模板，在引物 P1（5’ cgg ggt acc atg atc tcc cag aag ggt ctg

gac ttc g 3’ ）和引物 P2（5’ cgc gga tcc tta gtg tcc cct cca gaa aaa ctc3’）作用下，采用 PCR 法

扩增编码小鼠 BPI

36-259

抗菌蛋白的 muBPI

36-259

基因片段。反应条件为：95℃预变性 2min，

95℃变性 45s, 59.8 ℃退火 45s，72℃延伸 51s，72℃充分延伸 5min，4℃10min 终止反应，30

个循环。

1.2.3 pcDNA3.1（+）-muBPI36-259 重组质粒的构建和鉴定

用 BamHΙ 与 KpnΙ 分别双酶切 pcDNA3.1 (+)质粒和 muBPI

36-259

基因片段。取上述酶切

产物以 3：1 比例混合后，通过连接反应构建 pcDNA3.1（+）- muBPI

36-259

重组质粒。将

pcDNA3.1（+）-muBPI

36-259

重组质粒转化 E.coli DH5α，挑选阳性克隆菌小提质粒，进行酶

切鉴定和测序分析。

1.2.4 pEGFP-N1 对 RAW264.7 细胞的转染及其条件优化

采用电穿孔法将绿色荧光增强蛋白表达质粒 pEGFP-N1 转染 RAW264.7 细胞。取不同剂

量 pEGFP-N1 质粒 DNA（5、10、15、20、25、30µg）分别与 0.2mlRAW264.7 细胞（2×10

个/ml）悬液在 Eppendorf 管中混匀，4℃静置 10 分钟后将管内细胞悬液置于电转杯中，用不

同电压和脉冲时间进行电转染条件优化选择。然后将细胞混合液加入六孔板中置于 CO

孵

箱中培养，并在培养第 24h，48h 和 72h 在荧光和普通光学显微镜下观察各孔细胞计数转染

率。

1.2.5 pcDNA3.1 (+)-muBPI36-259 重组质粒对 RAW264.7 细胞的转染

实验分为三组：pcDNA3.1 (+)-muBPI

36-259

重组质粒转染实验组、pcDNA3.1 (+)空质粒转

染对照组和空白细胞对照组。①取 0.2ml RAW264.7 细胞悬液（2×10

个/ml）和最适剂量

（20µg）质粒 DNA 置于 Eppendorf 管中混匀；②4℃静置 10 分钟取管内细胞悬液置于电转

杯中，选择最佳电压和脉冲条件电击穿孔；③将杯中细胞混合液置于六孔板中，各孔补加

2ml 改良 RPMI1640 培养液后，将六孔板置于 CO

孵箱 37℃培养 48 小时，用于伤寒杆菌感

染和细胞内目的蛋白的检测。

1.2.6 muBPI36-259 目的蛋白在 RAW264.7 细胞内的表达

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