http://www.paper.edu.cn
- 1 -
小鼠 BPI N 端功能基因片段的克隆及其表达产物在胞
内杀菌作用的研究
1
李丽，冯颖，吕喆，孔庆利，刘振龙，赵冬，高燕，王炜，安云庆
首都医科大学免疫学系，北京（100069）
E-mail: doctor_lily1982@yahoo.cn
摘 要：目的：克隆小鼠 BPI
36-259
基因片段，转染细胞获得具有杀菌作用的目的抗菌蛋白。
方法：采用生物信息学方法，构建PUC57-muBPI
1-281
质粒；PCR扩增获得muBPI
36-259
基因片
段，制备pcDNA3.1 (+)-muBPI
36-259
重组质粒；采用电穿孔法将上述重组质粒转染RAW264.7
细胞，Western-blot法检测目的蛋白在胞内的表达；建立胞内杀菌实验模型，检测muBPI
36-259
目的蛋白对胞内寄生菌（伤寒杆菌）的杀伤作用。结果：muBPI
36-259
目的蛋白在RAW264.7
细胞内成功表达，对胞内寄生菌—G
-
伤寒杆菌具有杀伤作用。结论：成功克隆了小鼠BPI
36-259
基因片段，转染RAW264.7细胞获得具有生物学活性目的抗菌蛋白。
关键词：杀菌/渗透性增强蛋白；RAW264.7细胞；伤寒杆菌
中国图书分类号：R392
杀菌/渗透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein，BPI)是广泛存在于人、
牛、猪等多种哺乳动物多形核中性粒细胞中的一种 55KD 的阳离子抗菌蛋白
(1,2)
。因其兼备
中和内毒素和杀伤革兰氏阴性菌(GNB)双重作用而受到关注
(3)
。我们成功克隆了人 BPI 基因
和人 IgGFc 基因，制备了 AAV2-BPI-Fcγ1 重组病毒，将其转染小鼠两周后，可使小鼠对致
死量 E.coli 感染攻击产生良好的保护作用
(4,5)
。人 BPI 和 Fcγ1 为异源性蛋白，可引发小鼠免
疫应答产生相应抗体阻断目的抗菌蛋白的杀菌作用。因此，无法长期观察基因导入小鼠对
GNB 感染的抵抗作用，难以确定抗感染基因转染能否为临床感染高危人群提供一种有效预
防 GNB 感染的方法和途径。
为此，本研究拟克隆编码小鼠 BPI 功能片段的基因（muBPI
36-259
）和编码小鼠 IgGFc 基
因（Fcγ），制备 AAV2-muBPI
36-259
-Fcγ1 重组病毒载体，并通过观察目的基因产物在小鼠体
内能否引起免疫应答和基因转染小鼠对致死量 E.coli 感染攻击保护作用持续的时间，以确定
人 BPI-Fcγ1 嵌合基因转染在临床感染高危人群中应用的可行性。
采用生物信息学方法对小鼠 BPI 和人 BPI 基因进行同源分析，预测小鼠 BPI 功能片段，
获得 muBPI
36-259
基因片段，构建 pcDNA3.1 (+)-muBPI
36-259
重组质粒。然后采用电穿孔法将
上述重组质粒转染 RAW264.7 巨噬细胞，通过胞内杀菌试验
(6)
检测目的抗菌蛋白的杀菌活性。
1. 材料与方法
1.1 材料
BamHΙ、KpnΙ 限制性内切酶，T4 DNA 连接酶，Go Taq polymerase 购自 Promega 公司；
Qiagen 胶纯化回收试剂盒，购自北京欣经科生物技术有限公司；Tiangen 质粒小提试剂盒，
购自天根生化科技北京有限公司；威格拉斯大提质粒试剂盒购自威格拉斯生物技术北京有限
公司；伤寒杆菌（50071）为本室保存；RAW264.7 细胞为小鼠单核／巨噬细胞系（ATCC®
Number：CRL-2278™），购自中国协和医科大学细胞中心；绿色荧光增强蛋白表达质粒
pEGFPN1 为本室保存；pcDNA3.1 (+)质粒购自 Invitrogen 公司；兔抗鼠 BPI 多克隆抗体为本
1
本课题得到教育部博士学科点专项科研基金（20040025002）和北京市自然科学基金项目（7082016）的资
助。
剩余7页未读，继续阅读
资源评论
