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为了研究折射率不匹配引入的像差对共聚焦显微镜成像的影响,根据Richards 和Wolf 矢量衍射积分建立计算模型,分析共聚焦显微镜常用的两种情况中存在折射率不匹配时的点扩散函数(PSF),并通过实验进行验证。光束经过折射率不匹配的油-盖玻片-水聚焦时,探测深度从0.5 μm 增至10 μm ,其PSF 的z 轴半峰全宽(FWHM)从0.4391 μm 变为0.931 μm ,其光强最大值从1.161 降为0.4119。当探测深度为10 μm 时,折射率匹配的空气-空气-空气的PSF 的z 轴FWHM 为1.059 μm ,光强最大值为1;而折射率不匹配的空气-玻璃-水的PSF 的z 轴FWHM 为7.5 μm ,光强最大值为0.04632。当探测深度较大时,折射率不匹配引入的像差会导致光斑变大和不对称,能量分散,影响成像质量。
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52, 021801(2015)
激光与光电子学进展
Laser & Optoelectronics Progress
©2015《中国激光》杂志社
021801-1
折射率不匹配引入的像差对共聚焦显微成像的影响
肖 昀
1,2,3
张运海
1
檀慧明
1
1
中国科学院苏州生物医学工程技术研究所江苏省医用光学重点实验室, 江苏 苏州 215163
2
中国科学院大学, 北京 100049
3
中国科学院长春光学精密机械与物理研究所, 吉林 长春 130033
摘要 为了研究 折射率不匹配 引 入的像差对共 聚焦显微镜成 像的影响,根据 Richards 和 Wolf 矢量衍射 积 分建立计
算模型 ,分析 共聚焦显微 镜常用的两 种情况中存 在折射率不 匹配时的点 扩散函数(PSF),并通过 实验进行验 证。光
束经 过折射 率不匹 配 的油-盖玻 片-水聚焦 时,探测 深度从 0.5
μm
增至 10
μm
,其 PSF 的 z 轴半峰 全宽(FWHM)从
0.4391
μm
变为 0.931
μm
,其光强最大值从 1.161 降为 0.4119。 当探测深度为 10
μm
时,折射率匹配的空气-空气-
空气 的 PSF 的 z 轴 FWHM 为 1.059
μm
,光强 最大值 为 1;而 折射率 不匹 配 的空 气-玻璃-水的 PSF 的 z 轴 FWHM 为
7.5
μm
,光强 最大 值为 0.04632。 当探 测深 度较大 时,折 射率不 匹配 引入 的 像差 会导 致光斑 变大 和不 对 称,能 量分
散,影响成像质量。
关键词 共聚焦; 折射率不匹配; 点扩散函数; 矢量衍射积分
中图分类号 O439 文献标识码 A
doi: 10.3788/LOP52.021801
Effect of Aberration Induced by Refractive Index Mismatch on
Imaging in Confocal Microscopy
Xiao Yun
1,2,3
Zhang Yunhai
1
Tan Huiming
1
1
Jiangsu Key Laboratory of Medical Optics, Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology,
Chinese Academy of Science, Suzhou, Jiangsu 215613, China
2
University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
3
Changchun Institute of Optics, Fine Mechanics and Physics, Chinese Academy of Sciences,
Changchun, Jilin 130033, China
Abstract According to Wolf and Richard′ s vectorial diffraction integral, a model is established, and the point
spread function (PSF) in the two common conditions of confocal microscopy with a refractive index mismatch
to study the effect of aberration induced by refractive index mismatch on imaging in confocal microscopy. The
model is tested by experiment. When the beams focus into a spot through oil, coverslip and water, the full width
at half maximum (FWHM) of the PSF along the z axis is broadened from 0.4391
μm
to
0.931 μm
with the
detective depth from 0.5
μm
to 10
μm
. And the maximum intensity of the PSF is reduced from 1.161 to 0.4119.
When the detective depth is 10
μm
, the FWHM of the PSF with the refractive index match along the z axis is
1.059
μm
, and its maximum intensity is 1. But the FWHM of the PSF with refractive index mismatch along the z
axis is 7.5
μm
, and its maximum intensity is 0.04632. When the detective depth is large, the aberration induced
by refractive index mismatch can make light spot bigger, dispersive energy and influent the imaging quality.
Key words confocal; refractive index mismatch; point spread function; vectorial diffraction integral
OCIS codes 180.1790; 350.5730; 120.4820; 120.1880
收稿日期: 2014-08-10; 收到修改稿日期: 2014-08-19; 网络出版日期: 2015-01-15
基金项目: 国家重大科研装备研制项目(ZDYZ2013-1)、苏州医工所二期重大项目(Y052031205)和苏州应用基础研究计划
项目(SYG201324)
作者简介: 肖 昀(1988—),男,博士研究生,主要从事激光共聚焦显微镜成像技术方面的研究。E-mail: xiaoy@sibet.ac.cn
导师简介: 张运海(1975—),男,博士,研究员,博士生导师,主要从事超分辨显微光学成像技术方面的研究。
E-mail: zhangyh@sibet.ac.cn(通信联系人)
52, 021801(2015)
激光与光电子学进展
www.opticsjournal.net
021801-
1 引 言
激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)是研究微细结构的有效技术手段和必备的大型科学仪器,在生物和工业
检测领域 得 到了广泛 应 用。该系 统 采用精密 针 孔滤波技 术 ,使得 只 有处于焦 平 面 位置上的 信 息能够被 探
测,最大限度地抑制了非聚焦平面的杂散光,具有很高的成像分辨率和信噪比
[1]
;同时系统沿 z 轴方向可以实
现无损光学断层扫描,从而实现对较厚样本的三维成像
[2]
。用于生物学研究的 SCM,在组织生物学、细胞生
物学、分子生物学、基因学、胚 胎学、神经 学、病 理学、免疫学、流行病学、肿瘤学、细 菌学、病毒 学等领域具有
广阔的应用
[3]
。
共聚焦显微技术的概念最早由 Minsky 在 20 世纪 50 年代提出,第一台商业化的共聚焦显微镜直到 1987
年才问世。此后共聚焦显微技术引起了人们的高度重视,在理论和实践上不断出现新的进展,在理论上,更
加全面地研究了系统的各种特性,提出了许多改进成像质量、提高成 像分辨率的方案
[4-5]
;在实践方面,具备
各种新功能的共聚焦显微镜不断进入市场。
共聚焦显 微 镜 能提供很高 成 像 质量的生 物 组 织图片,但在实际使 用 时 很多因素 会 降 低最终的成 像 质
量,常见的因 素 有激光功 率 大小的设 置 、探 测 器如光 电 倍增管阈 值 和增益的 设 置、荧 光发射波 长 范围的 选
取、折射率不匹配引入的像差等,这其中折射率不匹配引入的像差直接使得系统成像的点扩散函数(PSF)变
差,使 得 系 统 成 像 的 分 辨 率 和 信噪比同时受到影响,在 实 际 使 用 中经常存在而又不被使 用 者 觉 察 。早在
1993 年,Hell 等
[6]
根据 Fresnel-Kirchhoff 积分讨 论了入 射光聚焦 中折射 率不匹 配的问 题,并分析 了折射 率
不匹 配引入的像差对 共聚焦显微镜焦 点位置、z 轴峰值和 PSF 的半 峰全宽(FWHM)等 的影 响。但是此积分
公式由格林定量推导,这要求电场和其展开式的前两项在积分区域内和边界处具有连续性。而这和电场垂
直分量、磁场的切向分量不符,因此最后的积分公式不够严谨。1994 年,Hell 等
[7]
以相同的理论为基础,分析
了双光子共 聚焦显微镜 中折射率不 匹配的问题 。2001 年,Booth 等
[8]
根据 Gibson 等
[9]
的像差公式 研究了单
光子和双光子显微镜中折射率不匹配引入的像差和像差校正的应用。2002 年,Alberto 等
[10]
通过实验分析了
折射率不匹配对高分辨共聚焦显微镜的 影响。而 Török 等
[11]
根据 Richards 和 Wolf 矢量衍射积分给出了电
场经过介质界面聚焦的积分表达式。为了精确分析折射率不匹配对共聚焦显微镜的分析,本文在 Török 等
的基础上结合理论和实验研究了折射率不匹配对系统成像质量的影响。
2 多种介质下物镜焦点处光波场模型
共聚焦显微镜在使用时,常见的情况是对生物组织切片进行观察,如图 1 所示,组织切片置于盖玻片和
载玻片之间的组织溶液中,盖玻片和物镜之间充盈着填充介质,对于干性物镜该填充介质为空气,对于浸油
物镜为浸油。从物镜出来的汇聚球面波前将经过填充介质、盖玻片、组织溶液,最终在组织溶液中汇聚成一
个照明光点,假定填充介质、盖玻片、组织溶液的折射率分别为 n
1
、n
2
、n
3
,忽略组织溶液和组织之间折射率的
差异,盖玻片 n
2
的折射率约为 1.515,组织培养液的折射率 n
3
约为 1.33。如果填充介质为浸油,则折射率 n
1
为
1.518;如果填充介质为空气,则折射率 n
1
为 1.00。从物镜出射的汇聚球面波经过这三种介质时,由于介质的
折射 率不相同,从而 产生 像差 ,导致 实际 会聚 焦点 偏离 高斯 焦点,使得 照明 PSF 能量分散,降低 系统 最终 的
成像分辨率和信噪比。图 1 中 p
0
为高斯焦点,p
1
为实际焦点,高斯焦点到盖玻片的距离为探测深度,记为 d
0
,
实际焦点 p
1
到高斯焦点 p
0
之间的距离记为 d
1
。
图 1 对组织切片进行观察时的光传播情况
Fig.1 Light propagation observing the tissue section
2
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