生物信息学预测及人Elp3敲除序列表达载体的构建

生物信息学是一门运用计算机技术、数学与统计方法以及生物学原理相结合，分析和解释生物学数据的学科。在本研究中，生物信息学预测和构建了人类中一个名为Elp3（elongator complex subunit 3）的敲除表达载体，以研究其结构和功能。 研究目的主要是利用生物信息学方法预测Elp3蛋白的三维结构，进而构建其敲除序列的表达载体，通过体外实验鉴定其结构与表达。研究方法包括同源建模、双酶切、测序鉴定、以及RT-PCR和western blot技术。 同源建模是一种基于已知蛋白质结构模板，预测未知蛋白结构的方法。在构建Elp3敲除表达载体时，研究人员首先利用同源建模技术分析Elp3蛋白序列，以此确定敲除的目标区段。然后基于这些分析结果，构建重组表达载体，即删除掉特定的基因片段。 双酶切是一种分子生物学中的技术，可以将DNA序列在特定位点切开。这一步骤用于验证构建的重组表达载体是否成功，因为只有在正确的位置切开载体，才能得到预期的DNA片段。测序鉴定则是进一步确认载体构建的准确性，通过序列测定来确保载体中插入的是正确的敲除序列。 RT-PCR技术（反转录聚合酶链式反应）用于检测特定的mRNA水平，这里用于验证是否准确地检测到了目标mRNA。Western blot则是一种用于检测蛋白质表达水平的技术，通过特定抗体识别和检测目标蛋白条带。 研究结果表明，成功构建了基于Elp3蛋白全长的四个删除重组表达质粒，即PIRES2-EGFP-Elp3-d1、PIRES2-EGFP-Elp3-d2、PIRES2-EGFP-Elp3-d3、PIRES2-EGFP-Elp3-d4以及一个Elp3过表达质粒PIRES2-EGFP-Elp3。通过双酶切和测序鉴定得到了正确的目的序列。RT-PCR结果表明，正确检测到了mRNA条带，elP3-d1（1374 bp）、elP3-d2（1110 bp）、elP3-d3（1239 bp）、elP3-d4（636 bp）和elP3（1692 bp）。Western blot结果同样准确地检测出了目标蛋白条带，Elp3-d1（50 KDa）、Elp3-d2（40 KDa）、Elp3-d3（45 KDa）、Elp3-d4（27 KDa）和Elp3（62 KDa）。 Elp3蛋白是Elongator复合物的一个组成部分，该复合物最初于1999年从酵母中被分离出来。人类的Elongator复合物于2002年被分离纯化，与酵母中的Elongator复合物类似，人类的Elp3可以直接与RNA聚合酶II相互作用。Elp3的研究对于理解RNA聚合酶II的调控和转录后修饰有着重要意义。 值得注意的是，研究中所提及的PIRES2-EGFP是一个常见的载体系统，含有双顺反子（IRES）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标签。这种载体系统允许同时表达两种蛋白，一种是目标蛋白，另一种是作为报告蛋白的绿色荧光蛋白，以方便后续的检测和分析。 研究成功构建了Elp3的敲除表达载体，为后续研究Elp3的功能和机制打下了基础。通过这些方法和结果，可以观察到Elp3的表达和结构特征，从而深入探究其生物学功能。此外，Elongator复合物的研究对理解人类基因表达的复杂调控机制具有重要价值。