用圆二色性和荧光光谱技术研究纳米吡(2010年)资源-CSDN文库

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Ｖｏｌ．３１高等学校化学学报Ｎｏ．５

２０１０年５月

　　　　　ＣＨＥＭＩＣＡＬＪＯＵＲＮＡＬＯＦＣＨＩＮＥＳＥＵＮＩＶＥＲＳＩＴＩＥＳ　　　　　　８９６～９０４

用圆二色性和荧光光谱技术研究纳米

吡啰红Ｇ核－铁蛋白的构建机理

陈盈盈

１

，黄　琳

１，３

，季学涛

１

，林　青

１

，陈　平

１

，柯才焕

２

，黄河清

１，２，３

（１．厦门大学生命科学学院生物化学与生物技术学系，

２．海洋与环境科学学院，近海海洋环境科学国家重点实验室，

３．化学化工学院，福建省化学生物学重点实验室，厦门３６１００５）

摘要　小批量制备了电泳纯鲨鱼肝铁蛋白（ＬｉｖｅｒｆｅｒｒｉｔｉｎｏｆＳｐｈｙｒｎａｚｙｇａｅｎａ，ＳＺＬＦ），对ＳＺＬＦ的结构与功能进

行了研究．在ｐＨ＝２畅０～１０畅０条件下，选用圆二色性（Ｃｉｒｃｕｌａｒｄｉｃｈｒｏｉｓｍ，ＣＤ）光谱技术研究了ＳＺＬＦ和脱铁

核ＳＺＬＦ（ａｐｏＳＺＬＦ）二级结构转换的基本特征和变化趋势，揭示了ＳＺＬＦ蛋白壳的亚基稳定性、相互作用强度

和去折叠现象．利用酸碱中和方法，解离ＳＺＬＦ蛋白壳亚基，并再次构建成完整ＳＺＬＦ．用紫外－可见分光光度

法和荧光光度法研究了构建纳米吡啰红Ｇ核－铁蛋白的途径．定量分析结果表明，每分子ａｐｏＳＺＬＦ可捕获１２

分子吡啰红Ｇ于蛋白壳内，构建纳米吡啰红Ｇ核－铁蛋白．分析了ａｐｏＳＺＬＦ直接捕获和释放吡啰红Ｇ的途径

与速率，为后续构建高存量纳米顺铂核－铁蛋白药物载体提供了可行性技术．

关键词　铁蛋白；结构转换；纳米吡啰红Ｇ核－铁蛋白；光谱分析

中图分类号　Ｏ６５７　　　　文献标识码　Ａ　　　　文章编号　０２５１－０７９０（２０１０）０５－０８９６－０９

收稿日期：２００９－０７－２２．

基金项目：国家自然科学基金（批准号：３０８７０５１５）和国家“ 九七三” 计划项目（批准号：２０１０ＣＢ１２６４０）资助．

联系人简介：黄河清，男，教授，博士生导师，主要从事生物分析化学研究．Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｑｈｕａｎｇ＠ｘｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

在自然界中，多数动植物及微生物细胞中均存在着一种高效和高存量储存无机铁磷的蛋白质

［１］

．

铁蛋白分子结构主要由蛋白壳、铁核和横跨蛋白壳的物质隧道组成

［２，３］

，其中蛋白壳由２４个同一类型

或不同类型（Ｈ和Ｌ）的亚基组成

［４，５］

，铁核由数千个无机铁氧化合物和数百无机磷酸盐组成

［１，２］

．与细

胞色素Ｃ类似，铁蛋白亚基由４α螺旋束结构构成，在金属电极或修饰电极上均表现出非电惰性特点，

即可以从金属电极中接受还原电子，并转化成化学能，供自身铁核进行氧化还原反应

［６，７］

，这一特点与

铁蛋白特殊亚基结构和高对称性亚基排布组合有关，但采用铁蛋白电极直接测定生物大分子的氧化还

原电位，或把电能转换为化学能供细胞或组织使用，还需进一步提高铁蛋白从电极上接收和传递电子

的速率．

铁核置换与亚基重组研究指出，铁蛋白铁核可被置换成锰核、铜核、银／金核、锢核或铀核，并用

于开展治疗肿瘤疾病

［８，９］

或研制高容量磁盘．铁蛋白反应器可直接捕获流动水体中的中性红、劳氏紫

及各种有机磷农药等有机小分子，用于连续监测和评估环境污染程度．据推测，在这一捕获过程中，

铁蛋白亚基之间出现瞬间错位，达到了拓宽隧道通道效果，有利于直接捕获有机小分子

［２］

．选用酸碱

中和技术可直接使铁蛋白壳亚基解离与重组，并用于在蛋白壳内捕获抗肿瘤药物１４羟正定霉素

（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ），构建１４羟正定霉素－铁蛋白载体

［１０］

．近期，作者选用透射电子显微镜技术研究ＳＺＬＦ铁

核和蛋白壳亚基解离和重组的全过程，成功地构建了纳米胰岛素核－铁蛋白

［１１］

，但有关铁蛋白亚基解

离与重组技术捕获有机小分子或多肽的途径与机理，尤其是亚基解离和重组过程中的 α螺旋折叠、去

折叠和二级结构转换等问题，至今尚不清楚．

选用透射电子显微镜（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＴＥＭ）技术可直接观测到不同酸度条件下

铁蛋白的蛋白壳和铁核的分子尺寸变化的趋势与规律，从而揭示了魟鱼肝铁蛋白（Ｌｉｖｅｒｆｅｒｒｉｔｉｎｏｆ

Ｄａｓｙａｔｉｓａｋａｊｅｉ，ＤＡＬＦ）和猪胰铁蛋白（Ｐｉｇｐａｎｃｒｅａｔｉｃｆｅｒｒｉｔｉｎ，ＰＰＦ）中Ｈ－Ｈ，Ｈ－Ｌ和Ｌ－Ｌ亚基之间的相互

作用情况

［１２，１３］

．采用外延Ｘ射线晶体结构分析技术也陆续揭示了铁蛋白精细结构和关键氨基酸残基

的生物功能．对于铁蛋白蛋白壳亚基二级结构转换现象，Ｍａｒｉａ等

［１４］

利用ＣＤ技术进行了初步的研究，

并较为详细地描述和揭示了二级结构转换的趋势，但针对铁蛋白亚基解离（去折叠）或重组后（折叠）

后的生物功能的研究却很少．

本文以由单类型亚基组成的ＳＺＬＦ为研究材料，选用圆二色性、紫外－可见光谱和荧光光谱技术为

分析手段，研究了在弱酸和弱碱环境下，ＳＺＬＦ产生亚基解离、去折叠、折叠和重组为铁蛋白的分子机

制，构建了纳米吡啰红Ｇ核－铁蛋白，并揭示其构建机理，所拓展的构建与分析技术可为后续开展纳米

药物核－铁蛋白（如纳米顺铂核－铁蛋白）研究提供可行性技术．

１　实验部分

１．１　试剂与仪器

马脾铁蛋白（ＨＳＦ，美国Ｓｉｇｍａ公司）；牛血清白蛋白（ＢＳＡ，Ｓａｎｇｏｎ公司）；三（羟甲基）氨基甲烷

（Ｔｒｉｓ，Ｓａｎｇｏｎ公司）；三氟乙酸（ＴＦＡ，日本东京化成工业株式会社）；ＤＥＡＥ纤维素－５２（Ｗａｔｅｍａｎ公

司）；ＳＤＳ分子量标准Ｍａｒｋｅｒ（Ｓｉｇｍａ公司）．２，５－二羟基苯甲酸（ＤＨＢ）、２－氰基－４－羟基肉桂酸（ＨＣＣＡ）

及芥子酸（ＳＡ）均购于美国ＩＣＮ生物医学公司．用于分离纯化与鉴定铁蛋白所需试剂均为上海生工公

司和Ｓｉｇｍａ公司的色谱纯产品．

超滤离心管截留分子量分别为１００００和１０００００；ＡＫＴＡＰｕｒｉｆｉｅｒ１００快速蛋白纯化系统（瑞典Ａｍｅｒ－

ｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司）；ＪＥＭ２１００ＨＣ透射电子显微镜（日本电子公司）；ＪａｓｃｏＪ－８１０型圆二色光谱仪

（日本分光公司）；ＤＵ６５０型紫外－可见分光光度计（美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司）；Ｆ－２０００型荧光分光光度计

（日本日立公司）；ＲＥＦＬＥＸ Ⅲ型基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ，德国

Ｂｒｕｋｅｒ公司）．

１．２　实验过程

１．２．１　铁蛋白的制备和鉴定　小批量ＳＺＬＦ的提取、分离、纯化和浓缩技术均参照文献［１１］方法进

行．铁蛋白分子量测定和迁移率等理化参数的测定参照文献［１５］方法进行．采用考马斯亮蓝法测定铁

蛋白的蛋白含量．

１．２．２　铁蛋白亚基和亚基类型分析　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ采用Ｔｒｉｓ－甘氨酸不连续电泳体系（浓缩胶ｐＨ＝６畅８，

分离胶ｐＨ＝８畅８），浓缩胶浓度５％，分离胶浓度１５％，浓缩胶电压７０Ｖ，分离胶电压２００Ｖ，电泳分离

过程在４ ℃下进行．ＳＤＳ电泳的样品处理：将铁蛋白与ＳＤＳ样品缓冲液以体积比４∶１混合后，于１００ ℃

加热４～５ｍｉｎ，随后离心，去除沉淀物，收集上清液用于电泳分离．考马斯亮蓝染色和脱色参照文献

［１６］方法进行．铁蛋白的亚基鉴定选用肽质量指纹图谱（Ｐｅｐｔｉｄｅｍａｓｓｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，ＰＭＦ）技术

［１６］

、网

上数据库（ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ、ＴｒＥＭＢＬ、Ｍｓ－Ｆｉｔ网站ＮＣＢＩｎｒ）和Ｐａｗｓ软件进行鉴定、比对和分析．检索设置

参数为：ＤｉｇｅｓｔＵｓｅｄ：Ｔｒｙｐｓｉｎ；Ｍａｘ．＃ＭｉｓｓｅｄＣｌｅａｖａｇｅｓ：２；ＣｏｎｓｔａｎｔＭｏｄｓ：ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ（Ｃ）；Ｍａｘｉ－

ｍｕｍＲｅｐｏｒｔＨｉｔｓ：２０；ＰｏｓｓｉｂｌｅＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＯｘｉｄａｔｉｏｎｏｆＭ；ＭｉｎｉｍｕｍＭａｔｃｈｅｓ：４；ＳｏｒｔＴｙｐｅ：ＳｃｏｒｅＳｏｒｔ；

ＭｉｎＰａｒｅｎｔＩｏｎＭａｔｃｈｅｓ：１；ＭＯＷＳＥＯｎ：１；ＭＯＷＳＥＰＦａｃｔｏｒ：０畅４．

１．２．３　圆二色性光谱测定ＳＺＬＦ二级结构转换　将浓缩后的电泳纯ＳＺＬＦ样品加入到不同ｐＨ值的

ＴＦＡ－ＮａＯＨ缓冲液中，使实验蛋白质的终浓度为０畅１ｍｇ／ｍＬ．室温下将样品放置４ｈ．样品ｐＨ值采用

高精度的ｐＨ酸度计进行监控．取不同ｐＨ值的ＳＺＬＦ样品０畅６ｍＬ，用Ｊ－８１０型ＣＤ光谱仪进行测定．石

英样品池的光程为０畅１ｃｍ，灵敏度为２ｍｄｅｇ／ｃｍ，扫描测定波长范围１９０～２６０ｎｍ，扫描时间０畅５ｓ，

扫描速度１００ｎｍ／ｍｉｎ，分辨率０畅１ｎｍ，在室温下测定铁蛋白的ＣＤ光谱．

１．２．４　铁蛋白亚基解离和构建纳米吡啰红Ｇ核－铁蛋白　铁蛋白亚基解离和构建纳米吡啰红Ｇ核－铁

蛋白的主要实验步骤如下：（１）在室温下，取２ｍＬａｐｏＳＺＬＦ样品（２ｍｇ／ｍＬ）加入１ｍＬ甘氨酸－醋酸缓

冲液（ｐＨ＝２畅５）中，用弱酸调节样品ｐＨ＝２畅５，并对铁蛋白样品进行荧光和紫外－可见光谱全扫描．

（２）将铁蛋白样品用弱酸处理２０ｍｉｎ，加入吡啰红Ｇ并控制其终浓度为６００ μｍｏｌ／ｍＬ．反应进行３ｍｉｎ

后，用４畅０ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝７畅０）调节样品的ｐＨ值至４畅０，随后静置３０ｍｉｎ后，收集样品且进行紫

７９８

Ｎｏ．５　陈盈盈等：用圆二色性和荧光光谱技术研究纳米吡啰红Ｇ核－铁蛋白的构建机理

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