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植物高通量细菌分离培养和鉴定11
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2022-08-08
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2.将根系样品表面的土壤颗粒及连接不紧密的微生物清洗掉 3.将根系研磨成匀浆 4.将根系匀浆液转移至含有25mL的10mM氯化镁的50mL管中,混匀,室温下静置
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水稻高通量分离培养细菌和高通量鉴定
Title(英文)
标题要求准确、简洁且尽可能体现实验方案的专一性
英文标题要与中文标题要严格对应以方便被英文文献引用
作者 1
1, #
,作者 2
1, 2, #, $
,作者 3
2
,作者 4
2,
*
1
学院/系/研究中心,学校/研究所,城市,省;
2
学院/系/研究中心,学校/研究所,城市,省;
学院/系/研究中心,学校/研究所,城市,省;
$
现工作单位:学院/系/研究中心,学校/研究所,
城市,省
*通讯作者邮箱:
#
共同第一作者/同等贡献
摘要
培养在特定环境下生长的植物根系微生物组,对于研究根系微生物对植物生长和健康的作用
至关重要。本方法从新鲜植物根系中高通量分离培养细菌,使用梯度稀释的方法增加获得单
一细菌的比例,采用双边标记 PCR 扩增法高通量鉴定分离培养细菌的 16S rRNA 基因。为便
于 数 据 处 理 , 开 发 了 一 个 简 单 易 用 的 生 物 信 息 分 析 流 程 Culturome
(https://github.com/YongxinLiu/Culturome) 和 一 个 图 形 用 户 界 面 web 服 务 器
(http://bailab.genetics.ac.cn/culturome/)。该方法允许任何研究组(2-3 个实验室成员,没有生物
信息学专业知识)在 8-9 周内系统地培养植物根系相关细菌。
关键词: 根系微生物组,高通量分离,高通量鉴定,生物信息分析
材料与试剂
一. 生物材料
样品来源于水稻根系(Oryza sativa L. Nipponbare),植物材料可从作者处获得。
二. 试剂
胰蛋白胨大豆肉汤 (TSB, OXOID, cat. no. CM0129)
氯化镁 (MgCl
2
·6H
2
O, SIGMA, cat. no. 63068-250G)
氯化钠 (NaCl, SIGMA, cat. no. S7653-250G)
磷酸氢二钠 (Na
2
HPO
4
·2H
2
O, SIGMA, cat. no. 04272-1KG)
磷酸二氢钠 (NaH
2
PO
4
·H
2
O, SIGMA, cat. no. 71504-250G)
氢氧化钠 (NaOH, SIGMA, cat. no. S8045-500G)
乙二胺四乙酸二钠 (Na
2
-EDTA, Amresco, cat. no. 0105)
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCl, Genview, cat. no. BT504-500G)
甘油 (SIGMA, cat. no. G7893)
琼脂粉 (SIGMA, cat. no. A7921-100G)
琼脂糖 (Biowest, cat. no. G-10)
乙醇 (SIGMA, cat. no. E7023-500ML)
无核酸酶水 (QIAGEN, cat. no. 129115)
PCR 引物 (Life Technologies)
PCR 反应体系试剂 (TAKARA, cat. no. R007Z)
2000-bp Plus DNA 标准物 (DiNing, cat. no. DM1003)
DNA 染色剂 (NIPPON Genetics EUROPE GmbH, cat. no. MG 04)
胶回收试剂盒 (Wizard
®
SV Gel and PCR Clean-up System, Promega, cat. no. A9282)
磁珠 (Agencourt AMPure XP beads, Beckman, cat. no. A63882)
PicoGreen 荧光染料 (Invitrogen, cat. no. P7589)
三羟甲基氨基甲烷 (Tris, Vetec, cat. no. V900483-500G)
乙酸 (Rhawn, cat. no. R049946-500mL)
E. coli (TIANGEN BIOTECH, DH5α, cat. no. CB101-03)
上样缓冲液 (TAKARA, cat. no. 9156)
仪器设备
镊子 (Jinzhong, cat. no. JD5020)
剪刀 (Jinzhong, cat. no. J21130)
切胶刀片 (Jinzhong, cat. no. J11010)
滤纸 (SEP, cat. no. DXLZ11F)
50-mL 离心管 (BD Falcon, cat. no. 352070)
微量离心管 (1.5-, 5-mL; Eppendorf, cat. nos. 0030125.150, 30119401)
塑料研磨棒 (Huaaobio, cat. no. SLXMB-1.5)
13-cm 方板 (Axygen, cat. no. ASJ-17-9142)
60-mm 培养皿 (Corning, cat. no. 430166)
96 孔 PCR 板 (Jet Keen Biotechnology, cat. no. PC-0200-9B)
96 孔细胞培养板 (NEST, cat. no. 701001)
96 孔酶标板 (Costar, cat. no. 3590)
2.0-mL 冻存管 (NEST, cat. no. 607001)
Microbank 菌保管 (Prolab, cat. no. PL.170/M)
12 通道移液器 (10, 100, 300 µL; Eppendorf, cat. nos. 3122000027, 3122000043, 31220000
60)
单道移液器 (10, 20, 100, 200, 1000 µL; Eppendorf, cat. nos. 3120000020, 3120000038, 3
120000046, 3120000054, 3120000062)
移液器枪头 (nuclease-free, 10, 200, 1000 µL; Axygen, cat. nos. T-300, T-200-Y, T-1000-
B)Parafilm 封口膜 (Bemis, cat. no. PM-996)
96 孔 PCR 板封板膜 (Axygen, cat. no. PCR-TS)
生物安全柜 (Thermo Fisher Scientific, cat. no. BSC-1000IIA2)
旋涡混合器 (TIAGEN BIOTECH, cat. no. OSE-VS-01)
电子天平 (Mettler Toledo, cat. no. AL104)
平板摇床 (Kylin-Bell Lab Instruments, model no. TS-2)
恒温摇床 (Shanghai Zhichu Instrument, cat. no. ZQZY-CF)
微孔板离心机 (TIANGEN BIOTECH, cat. no. OSE-MP26)
PCR 仪 (T100
TM
; BIO-RAD, model no. 1861096)
电泳仪 (JUNYI-DONGFANG, cat. no. JY300HC)
凝胶成像仪 (BIO-RAD, model no. Universal Hood II)
酶标仪 (Molecular Devices
®
, model no: PARADIGM)
紫外分光光度计 (Thermo Fisher Scientific, model no. NanoDrop ND-2000)
高速离心机 (Eppendorf, model no. 5810R)
磁力架 (Thermo Fisher Scientific, cat. no. 12321D)
高速微型离心机 (Thermo Fisher Scientific, model no. Heraeus Pico 17)
–80°C 超低温冰箱 (Thermo Fisher Scientific, model no. 907)
–20°C 冰箱 (Haier, cat. no. DW-40L92)
软件和数据库【可选】
软件/数据库名称 (版本, 下载链接)
提供此实验所需的全部软件和数据库的版本,无版本可提供下载日期和文件大小。实验中软
件安装和使用的异常处理,可在失败经验部分详细撰写。
实验步骤
一. 预实验初步确定最适稀释浓度
1.从自然土壤中采集植物新鲜根系样品。将水稻连根拔出,采集水稻 10cm 的根系样品约
3g,放入 50mL 的无菌离心管中。
2.将根系样品表面的土壤颗粒及连接不紧密的微生物清洗掉。为了获得与根系紧密联系的微
生物,首先用无菌水将肉眼可见的大块土壤颗粒洗掉。接着将根系转移至新的 50mL 离心管,
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