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RNA干扰技术的特点.doc
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RNA干扰技术的特点.doc
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RNAi 具有的特征
①RNAi 是转录后水平的基因沉默机制;
②RNAi 具有很高的特异性,只降解与之序列相应的单个源基因的 mRNA;
③RNAi 抑制基因表达具有很高的效率,表型可以到达缺失突变体表型的程度,
而且相对很少量的 dsRNA 分子〔数量远远少于源 mRNA 的数量〕就能完全抑
制相应基因的表达,是以催化放大的方式进展的;
④RNAi 抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维
持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点;
⑤dsRNA 不得短于 21 个碱基,并且长链 dsRNA 也在细胞被 Dicer 酶切割为
21 bp 左右的 siRNA,并由 siRNA 来介导 mRNA 切割。而且大于 30 bp 的
dsRNA 不能在哺乳动物中诱导特异的 RNA 干扰,而是细胞非特异性和全面的
基因表达受抑和凋亡;
⑥ATP 依赖性:在去除 ATP 的样品中 RNA 干扰现象降低或消失显示 RNA 干扰
是一个 ATP 依赖的过程。可能是 Dicer 和 RISC 的酶切反响必须由 ATP 提供能
量。
RNAi 的生物特性
RNAi 抑制转座子活性
两方面的证据提示转座子活性的抑制与 siRNA 有关
① 发现蠕虫 mut-7 基因参与 RNAi 并且与转座子的转座抑制有关;
② 在果蝇中, 参与 RNAi 的 RNA 解螺旋酶 Spindle-E 的突变将导致该基因引起
的基因沉默的缺失, 同时提高了反转录转座子活性。
RNAi 抵御病毒感染
在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现 , sgs2/sde1 基因突变的拟南芥对
病毒的侵染表现出高度的敏感性。
RNAi 参与异染色质的形成和维持
Hall 等研究说明,着丝粒同源重复序列和 RNAi 组分一起正负调节着异染色质的
形成并共同促使异染色质组装成核;Vople 等在敲除裂殖酵母( S. pombe) 的
RNAi 途径基因( 如 Argonaute、Dicer 、RDRP) 时发现异染色质转录得到的
dsRNA 可以在 RNAi 途径的参与下, 加工成 siRNA,si RNA 募集异染色质蛋白
1( HP1) , 然后靶向性引起相应异染色质区域的转基因沉默。
RNAi 参与机体的发育调控及生理代
RNAi 只 抑制转录 后的 基因 , 所以 RNAi 在 生 物 体发 育学 研究 中具 有优 势 。
Chuang 等用 RNAi 技术进一步证实了 AG、CLV3 、AP1 、PAN 等功能基因
在拟南芥花发育过程中的功能。在 RNAi 过程中形成的 RISC 复合物可根据不
同情况分别利用 si RNA 或 stRNA 行使不同的功能, 但最终均导致特定基因沉
默。
1.高效性:Elbashir 等在研究中发现分别为 25 nmol/L 与 100 nmol/L 的起始
双链 RNA 产生的结果是一样的,只是高浓度起始的更有效些。将双链 RNA 浓
度降低到 1.5 nmol/L 时产生的基因沉默效果变化不大,只有当浓度降低到
0.05 nmol/L 时,沉默的效果才消失。Holen 等也证实 1~100 nmol/L 的双
链 RNA 浓度对基因沉默的效果是一致的。这说明双链 RNA 介导的基因沉默效
率是相当高的。需要 ATP:Zamore 等认为 RNAi 过程中至少有 2 个步骤需要
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能量的供应:一是长的双链 RNA 被 Dicer 所酶切产生双链 RNA;二是在双链
RNA 与 RISC 结合解链后形成有活性的 RISC。
⒉ 特异性:Elbashir 等和 Brummel kamp 等发现在 21~23 个碱基对中有 1
~2 个碱基错配会大大降低对靶 mRNA 的降解效果。
⒊ 位置效应:Holen 等根据人 TF(tissue factor〕不同的位置各合成了 4 组双
链 RNA 来检测不同位置的双链 RNA 对基因沉默效率的影响。在不同浓度和不
同类型的细胞中,hTF167i 和 hTF372i 能够抑制 85%~90%的基因活性,
hTF562i 只能抑制局部基因活性,而 hTF478i 那么几乎没有抑制基因的活性。
他们还以 hTF167 为中心依次相差 3 个碱基对在其左右各合成了几组双链
RNA,有趣的是它们所能抑制该基因活性的能力以 hTF167 为中心依次递减。
特别是 hTF158i 和 hTF161i 只与 hTF167i 相距 9 个和 6 个碱基,但它们几乎
没有抑制该基因活性的能力。结果还说明双链 RNA 对 mRNA 的结合部位有碱
基偏好性,相对而言,GC 含量较低的 mRNA 被沉默效果较好。
⒋ 竞争效应:Hoten 等将 10 nmol/L 和 30 nmol/L 的 hTF167i 相比,两者的
沉默基因效果无差异,但将 20 nmol/L 基因抑制效果很差的 PSK314i 和 10
nmol/L 的 hTF167i 相混和后,hTF167i 产生的抑制效果明显降低。
⒌ 可传播性:在线虫中,双链 RNA 可以从起始位置传播到远的地方,甚至于
全身。Feinberg 和 Hunter 在线虫细胞膜上发现一种跨膜蛋白 SID1,它可以
将双链 RNA 转运出细胞,因此系统性的 RNAi 包括了 SID1 介导的双链 RNA
在细胞间的运输。但在果蝇上并未发现有此基因的同源物,因此在果蝇上通过
注射产生的 RNAi 不能扩散。
植物中 RNA 干扰具有如下特点:(1)在确定基因功能时具有靶向性,在一个沉
默载体中插入局部基因序列就能确定某一基因的功能;(2)能用来选择性地沉默
某一基因家族中的单个基因或同时沉默一个基因家族中的多个基因;(3)PTGS
能确定在敲除后发生发育早期死亡的基因功能;(4)PTGS 具有系统性,可以通
过植物的维管系统传递到植物的其它局部;(5)PTGS 易于用于大规模、高通量
的系统研究。人们通过构建 RNAi 文库已成功的对线虫胚胎发育进展了研究,
此项工作在植物体系的研究中也正不断取得进展。
1. 比同源重组法更加简便,周期大大缩短。2.对于哺乳动物,如对于一些敲除
后小鼠在胚胎时就会死亡的基因,可以在体外培养的细胞中利用 RNAi 技术
研究它的功能。3. 由于 RNAi 能高效特异的阻断基因的表达,它成为研究信
号传导通路的良好工具。4.R N Ai 还被用来研究在发育过程中起作用的基
因,如可用 RNAi 来阻断某些基因的表达,来研究他们是否在胚胎干细胞的
增殖和分化过程中起着关键作用。
RNAi途径主要存在于细胞浆中,与反义核酸、核酶相比,RNAi具有以
下特点。①特异性。siRNA是严格按照碱基配对法那么与靶mRNA结合
的,故只引起同源mRNA的降解。研究说明,在siRNA21~23个碱
基中,错配1~2个碱基就会大大降低干扰效应。②遗传性。dsRNA分子
可扩散至生物体各个细胞,干扰效应可遗传给后代。研究说明,通过注射或浸
泡siRNA,在二代线虫中仍可观察到对靶基因的抑制作用[12]。但这
种遗传效应可持续几代以及高等细胞中是否也存在上诉现象尚不明确。③位置
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效应。研究说明只有针对编码区的dsRNA才产生干扰效应,对含子区域的
dsRNA不产生干扰效应[13]。Kesharwani等[14]根据
人组织因子〔humantissuefactor,hTF〕的不同位置合
成了四组双链RNA分别观察其干扰效应,结果显示hTF167I和hTF
372I有85%~90%的基因沉默效率,hTF562I只能抑制局部基
因,hTF478I几乎无干扰效应。④放大效应。通过实验研究发现,少量
dsRNA就能够使大量目的基因沉默,即使细胞增殖50~100倍,这种
沉默现象仍然存在,说明RNAi存在扩增机制.
4.1 高度特异性当一段与基因同源的 dsRNA 注射入果蝇胚胎时,它可以特异
性地在果蝇体干扰靶基因的表达。而其他即使是与靶基因同属一个基因家族的
基因都不会受到干扰。
4.2 高穿透性 RNAi 具有距注射点远距离作用的能力。在线虫中干扰效应甚至
可通过生殖系统传递到后代个体。
4.3 高效率性 RNA 干扰作用是在目的基因被转录后,通过对细胞质中同源
mRNA 的快速降解,最终由于该基因缺少 mRNA 而无法产生蛋白质产物。果
蝇的 RNAi 实验结果在 2~3d 即可以得到结果,这是其他传统实验技术所无法
比较的。
4.4 高稳定性以 3’端悬垂,rI’碱基的 dsRNA 尤为稳定,无需像反义核酸那样
进展广泛的化学修饰以提高半衰期。
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