### RT-PCR 实验步骤详解
#### 一、实验器具准备与处理
##### 实验器具
- **移液枪**：适用于不同体积的操作，包括1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl。
- **吸头**：与移液枪匹配，用于精确吸取液体，包括1ml、200μl、20μl。
- **匀浆管**：5ml，用于样品混合或预处理。
- **EP管**：1.5ml、500μl、200μl，用于样品存储或反应容器。
- **试剂瓶**：棕色试剂瓶（广口），用于储存对光敏感的化学试剂，如75%乙醇。
- **量筒**：100ml，用于测量较大体积的液体。
- **容量瓶**：1000ml，用于准确配制溶液。
- **试管架**：适用于不同尺寸的试管，包括5ml、1.5ml、20μl。
- **铝制饭盒**：1-2个，可用于储存或干燥实验用品。
- **大瓷缸**：1个，用于浸泡或清洗实验用品。
- **锡泊纸**：用于包裹需要避光的物品。
- **卷纸**：2卷，用于实验过程中的清洁。
- **三角烧瓶**：带盖，用于存放或处理化学试剂。
##### 器具处理
- **塑料制品**：包括枪头、EP管、匀浆管等，需先用DEPC水浸泡过夜，之后甩干并在37°C烘箱中烘干。如果超过一个星期未使用，则需要再次高压灭菌。
- **玻璃制品**：先浸泡于酸中过夜，然后清洗干净，再浸泡于1‰ DEPC水中过夜，最后包覆锡纸并烤干备用。
- **匀浆器**：包括剪刀、镊子等金属工具，只需洗净后进行超声消毒即可，无需DEPC处理。
#### 二、试剂配制
##### DEPC水
- 配比：1ml DEPC + 双蒸水定容至1000ml。
- 使用：作为去RNA酶处理水，用于清洗或配制其他溶液。
##### 75%乙醇
- 制备方法：无水乙醇与DEPC水按比例混合，并在-20°C保存。
- 注意事项：DEPC水在高压灭菌前需添加适量水以防止水溢出或蒸发。
##### 异丙醇
- 存储：棕色瓶，避免光照影响。
##### 氯仿
- 存储：棕色瓶，避光保存。
##### 琼脂糖
#### 三、缓冲液配制
##### 电泳缓冲液 (5×TBE贮存液)
- 成分：Tris 54g、硼酸 27.5g、0.5M EDTA 20ml pH 8.0，加蒸馏水至1000ml。
- 使用方法：使用时将5×TBE稀释10倍成为0.5×TBE。
##### 上样缓冲液 (6×缓冲液，4°C保存)
- 成分：0.25% 溴酚蓝、0.25% 二甲苯青FF、30% 甘油。
#### 四、琼脂糖凝胶配制
##### 1.0%琼脂糖凝胶
- 制备：1.0g琼脂糖 + 100ml电泳缓冲液，微波加热至沸腾，冷却至60°C加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl。
- 凝固：室温放置30-45min或放入4°C冰箱加速凝固。
##### 1.5%琼脂糖凝胶
- 方法同上，仅改变琼脂糖用量为1.5g。
#### 五、需购置材料
- **Taq酶**：-20°C保存，一般品牌即可。
- **dNTP**：4°C保存，向生物公司购买。
- **oligo(dT)15**：-20°C保存，可选择经济实惠的品牌。
- **M-MLV**：-20°C保存，推荐使用Promega品牌。
- **RNasin**：-20°C保存，Promega品牌为佳。
- **DEPC**：4°C保存，5克足够使用。
- **Trizol**：4°C保存，根据实验需求选择不同品牌及规格。
- **Marker**：4°C保存，选择符合实验需要的产品。
- **电泳Loading Buffer**：4°C保存，可自行配制。
#### 六、引物合成
- **内参照**：GAPDH基因的引物序列
- 正义链：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
- 反义链：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'
- **退火温度计算**：2(A+T)+4(G+C)，取平均值后再上下浮动4-5°C。
- **引物稀释**：最终引物浓度为10pmol/μl。
#### 七、PCR产物电泳
- 电泳操作：取1-10μl PCR产物，加入6×上样缓冲液，进行电泳。
通过以上步骤，我们可以清晰地了解到RT-PCR实验的具体操作流程和技术要点。从实验器具的选择到试剂的配制，再到具体的实验步骤，每个环节都非常重要，确保实验结果的准确性和可靠性。
