- -.
Western blot 的原理、操作及注意事项
原理:
通过电泳区分不同的组分,并转移至固相支持物,通过特异性试剂(抗体)作为探针,
对靶物质进行检测,蛋白质的 Western 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测
定的特异敏感等多种特点,可检测到低至 1~5ng(最低可到 10-100pg)中等大小的靶
蛋白。
一、抗原的选择和制备
A:样品的制备
1 组织:
组织的处理方法:组织洗涤后加入 3 倍体积预冷的 PBS,0℃研磨,加入 5×STOP
buer,180W,6mins,0℃超声波破碎,5000rpm,5mins 离心,取上清。加入 β-
ME(9.5ml 加入 0.5ml),溴酚蓝(9.5ml 加入 0.5ml)煮沸 10min,分装后于-20℃保
存,用时取出,直接溶解上样。
2 细胞:
细胞的处理方法: 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入 5×STOP buer,收
集,180W,6mins,0℃超声波破碎,5000rpm ,5mins 离心,取上清。加入 β-
ME(9.5ml 加入 0.5ml),溴酚蓝(9.5ml 加入 0.5ml)煮沸 10min,分装后于-20℃保
存,用时取出,直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取(特例):
直接收集分泌液,加入 β-ME、溴酚蓝制样。
B:蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因
1.双缩脲法:
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速,但不很准确的测定
中,常用此法。硫铵不干扰显色,这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的
原理是 Cu2+ 与蛋白质的肽键,以及酪氨酸残基络合,形成紫蓝色络合物,此物在
540nm 波长处有最大吸收。双缩脲法常用于 0.5g/L~10g/L 含量的蛋白质溶液测定。干
扰物有硫醇,以及具有肽性质缓冲液,如 Tris、Good 缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物,
即用等体积 10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质,然后弃去上清液,再用已知体积的 1m NaOH
溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
2.Lowry 法:
此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应,即 Cu++与蛋白质在碱
性溶液中形成络合物,然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂(福林-酚试剂),结果得
到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多,适合于测定 20mg/L~400mg/L 含量的蛋白质
溶液。其干扰物质与双缩脲法相同,而且受他们的影响更大,硫醇和许多其他物质的存在
会使结果严重偏差。另外要注意的是,加入福林试剂时要特别小心,试剂只在酸性 pH 环
境中才稳定,上述提到的还原反应只有在 pH10 时才发生,因此,福林试剂加入到碱性的
Cu2+-蛋白质溶液中时,必须立刻搅拌,以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地
被 Cu2+-蛋白质络合物所还原。
3.紫外吸收法:
大多数蛋白质在 280nm 波长处有特征的最大吸收,这是由于蛋白质中有酪氨酸,色
氨酸和苯丙氨酸存在的缘故,因此,利用这个特异性吸收,可以计算蛋白质的含量。如果
没有干扰物质的存在,在 280nm 处的吸收可用于测定 0.1~0.5mg/ml 含量的蛋白质溶
液。部分纯化的蛋白质常含有核酸,核酸在 260nm 波长处有最大吸收。有核酸时,所测
- - 总结