目的基因到工程菌的构建.pdf

《目的基因到工程菌的构建》是一份详细阐述基因工程核心步骤和技术的文档。基因工程始于20世纪70年代，当时的科学家通过DNA改造实验，实现了体外重组DNA分子，并将其导入大肠杆菌中，开启了基因工程的新篇章。这一领域的理论基础包括 Avery等人的肺炎球菌转化实验，证实了DNA是生物遗传物质，Watson和Crick揭示的DNA双螺旋结构及其复制机制，以及遗传信息的中心法则，即DNA-RNA-蛋白质的信息传递路径。 基因工程技术的三个关键技术环节包括： 1. **限制性核酸内切酶**：它们能特异性地切割DNA分子，创建末端碱基互补的DNA片段。原核生物中的限制性内切酶不会切割自身的DNA，因为其识别序列要么不存在，要么已被修饰。 2. **DNA连接酶**：负责将两个末端互补的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子，这一过程无需模板指导。 3. **基因工程载体**：通常使用细菌质粒，这些小型环状DNA分子能携带目的基因进入宿主细胞，使目的基因得以复制和表达。理想的载体需具备自我稳定复制、易于分离纯化、多个限制性内切酶位点、可观察的表型特征等特性。 基因工程的基本过程涉及目的基因的获取、克隆、表达。对于真核细胞中的目的基因，由于其存在于染色体DNA中，且可能包含内含子，直接分离和表达较为复杂。常见的获取方法包括： 1. **PCR技术**：体外直接合成目的基因，随后克隆和表达。 2. **基因组文库或cDNA文库构建**：将生物体的全基因组或转录本分段克隆，通过筛选模型找到含有目的基因的重组克隆。 3. **基因差异表达分析**：利用差异表达数据来定位和获取目的基因。 "鸟枪法"是一种直接从生物基因组中分离目的基因的方法，通过限制酶切割DNA为多段，随机插入到受体细胞中。虽然这种方法效率较低，但操作简单，成本低廉，尤其适用于获得带有内含子的真核基因DNA片段。 基因工程涉及一系列精密的分子生物学技术，从目的基因的获取、修饰到在工程菌中的表达，每一步都需要精确的操作和精心的设计。这一领域的进步极大地推动了生物技术的发展，使得我们能够制造基因药物、改良作物和解决各种生物学问题。