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WB试验常见问题解答.doc
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[1]各位朋友:请教关于 SDS-PAGE 的问题。我的配胶体系如下:15%分离胶 4%浓缩胶水 2.3ml
2.7ml30%丙烯酰胺 5.0ml 0.67mlTris-HCL PH8.8 2.5ml PH6.8 0.5ml10%SDS 0.1ml 0.04ml10%APS
0.1ml 0.04ml TEMED 0.004ml 0.004ml 我的蛋白分子量是 11kd,浓缩胶 60V,40min,分离胶
90V,70min。跑胶时总是跑不直,呈抛物线型,请问是什么原因?我的试剂都是新配置的。谢谢!!!
答:[1]胶的配制方法;配制不同体积 15%胶 SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积<毫升> 15%胶 <
毫升> : 5 -- 10 --15-- 20-- 30-- 50 蒸馏水 : 0.5 -- 1.0-- 1.5 --
2.0 -- 3.0 --5.0 30%Acr-Bis<29:1>: 2.5 -- 5.0 -- 7.5 -- 10.0 -- 15.0--
25.0 1M Tris, pH8.8: 1.9-- 3.8 -- 5.7-- 7.6-- 11.4 -- 19.0 10%SDS :0.05--
0.1-- 0.15 -- 0.2-- 0.3-- 0.5 10%过硫酸铵: 0.05 -- 0.1 --0.15-- 0.2 --
0.3 -- 0.5 TEMED: 0.002-- 0.004 -- 0.006 -- 0.008 -- 0.012 -- 0.02 配制
不同体积 4%胶 SDS-PAGE 浓缩胶所需各成分的体积<毫升> 4%浓缩胶〔两块胶,5ml 超纯水 :
3.16ml40%Acr/Bic〔37.5:1 : 0.5ml0.5 mol/L Tris•HCl〔pH6.8 : 1.26ml10%SDS : 50
微升�微升�10%AP〔过硫酸胺 : 25 TEMED : 5 微升�加 TEMED 后,立即混匀即可灌胶。[2]注
意玻璃板一定要洗干净,这一点比较重要。如果玻璃板洗不干净,很容易造成楼主所说的现象。[3]
注意电泳液不要出问题〔是否过期了,是否把转移液当成电泳液了?,电泳液如果出问题,也会造
成楼主所说的现象。
[2] pvdf 膜到底能不能用丽春红染色来查看蛋白是否转上去 ?我转过很多次了,都没有看到过
丽春红显色。但是有看到有人说能染上,是在是不知道,请教给位大大了
答:[1]PVDF 膜肯定可以用丽春红染色的。我们这里的很多人基本上用 的都是 PVDF 膜,染膜用
的都是丽春红。大多数时候都能染出条带的。[2]下面是丽春红的配方:10X 丽春红染液丽春红 S
2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 蒸馏水至 100ml 使用时将其稀释 10 倍。当然现在有很多公司
直接卖配好的丽春红,因为其可以回收重复利用,所以可以买配好的丽春红。下面是一份丽春红的
说明书:1.将 PVDF 膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜浸没在丽春红染色液中,摇动 3-5 分钟或更
长时间,直至出现清晰条带。对结果作适当 记录。 2.用蒸馏水,PBS 或其它适当溶液漂洗 2-3 次,
每次 3-5 分钟,去除丽春红,进行后续的 Western 检测。 从使用说明中,我们可以看出,PVDF 膜是
可以用丽春红染色的。[3]我的染色方法是:转膜完成后,取出膜在甲醇里泡 1 分钟,然后在双蒸
水中过一下,放入丽春红里染色,室温,摇床上,时间是 5-30 分钟。然后把染好的膜放到双蒸水中
洗一下,不要洗的太久,把表面的丽春红洗掉就可以了。这时就可以看到红色的蛋白条带了。然后
把膜放在 TBST 中,室温,摇床上洗 3 次,每次 10 分钟。然后就可以往下做了。[4]丽春红的染色敏
感性和 ECL 敏感性差的很远呢。也就是说,及时丽春红染色染不出来,ECL 也有可能曝光曝出来的。
[5]感觉丽春红染色效果不是很好的,有时候清楚,有时候也不是很清楚。而且染色后再往下做后
面的结果会收到一定的影响。所以,如果熟练了,后面就可以不染色了。也可以上样的时候都上两
个孔的样,转膜后把这两个孔对应的膜剪下来染色,如果染上了,说明其他的也会染上的。
[3] 我做 WB,曾跑出过条带,就是有非特异性条带,准备摸一抗和二抗浓度,但后来就什么条带都
显不出来了,就算换成有条带时的浓度,条件也没变,就是做不出来,转膜后膜上能清晰看见预染
的彩虹 marker,但用丽春红染膜,却没明显的蛋白条带,就能看见泳道,请教实验室其它人,就说
是我转膜弥散,求助个位大侠,我该怎么做?说说我的 wb 条件:蛋白大小:50kd5%积层胶,10%分
离胶电泳先 100v,后 180v 转膜条件:冰水中恒压 100v 1h 湿转〔在转时电流在 200—400ma 变,
先小,后大,还有就是转移缓冲液在转时会冒好多泡泡,我用的是 NC 膜,滤纸两边个四层
答:[1]转膜的时候最好用衡流,试一下 380 毫安,半小时。转移液注意最好现配先用,不要用很多
次,这很重要,我一般应用不超过两次。[2]转膜的时候,夹胶和膜的夹子的松紧要适中,可以通过
调节滤纸的张数来控制夹子的松紧。[3]电泳的电压太大,减小电泳的电压。可以先用 80 伏 20 分
钟,然后 120 伏。也可以一直用 80 伏。也可以先用 60 伏,然后 80 伏。[4]可以适当增加曝光时间
试一下。
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[4]目的蛋白不表达。的 leilaliu wrote:这是我的操作步骤:取 0.1g 组织,加 1ml 裂解液〔1
mol/l tris.hcl 2.5ml ,NaCl 0.438g, TritonX-100 0.5ml, 蒸馏水至 50ml,使用时加了 100ug/ml
的 PMSF>,机械匀浆 2 分钟,冰上裂解 30 分钟,然后 14000g 10 分钟离心,取上清液。取 20ug 上样
量,然后 80V 浓缩胶,130V 分离胶,然后 80V,180mA 转膜 2 个小时,然后 5%封闭一个小时,室温。然
后一抗 1:500〔5%脱脂奶粉加 TBST 里面孵育一个晚上,TBST 清洗 3 次,每次 10 分钟。然后二抗 1:
2000 处理方式同一抗,孵育时间为 1 个小时,室温,TBST 清洗 3 次,每次 10 分钟。再用 ECL 处理
等等。
但是,我的目的蛋白:CaMKIIa 总是做不出来。狂哭。分子量是 50KD。
答:[1]上样量一般是 20-100 微克,你的上样量是 20 微克,你的条带很弱或者出不来,为什么不
加大上样量呢?可以加到 100 微克左右呀〔这点其实挺重要的。[2]你说:"80V,180mA 转膜 2 个
小时"。一般转膜的时候只能衡流或者衡压吧,怎么你的电流电压都是恒定的呢?转膜感觉还是衡
流好。我一般用 380 毫安湿转 30 分钟。当然转膜很多条件都是可以的。[3]一抗孵育最好在摇床
上,一抗孵育后,TBST 清洗 3 次,每次 5 分钟就可以了。[4]可以适当增加曝光时间。
[5]各位好,我现在遇到的问题是,立春红显色后效果很好〔师姐和实验老师都这么认为,虽然不
知道蛋白条带〔45KD 的具体位置,但是比对 Marker 还是可以感觉到那部分的条带很清晰的。但
是我始终做不出结果,现把步棸详解如下,希望大家帮我分析一下:1,封闭〔5%的脱脂奶粉一小
时,室温下摇床上进行。2,TBS/T 洗膜 3 次,每次 5 分钟。用滤纸去尽残液。3,孵育一抗〔cell
signaling,单克隆抗体,比例是 1:1000<说明书上标示>。先室温摇床上 1 小时,再放在 4 度冰箱
过夜。4,TBS/T 洗膜 3 次,每次 5 分钟。用滤纸去尽残液。5,孵育二抗〔博士德,比例是 1:5000
〔我用的说明书上的最大标示。室温摇床 2 小时。6,TBS/T 洗膜 3 次,每次 5 分钟。用滤纸去尽
残液。7,加入 pierce 显色试剂〔按说明书要求进行。8,曝光 5 分钟,显影〔至今为出现目的条带,
定影。〔把膜拿到暗室观察什么都没有,只有一些荧光液的残留痕迹,成隐约大片状,多出现于膜
的边缘处,绝对不成条带状。
答:[1]细节决定成败![2]你说你的显色液都是荧光了。我估计你每次做完了,显色用的器具都
不洗吧?其实很多人都不在意,这点其实很重要的,就是凡是和膜接触的东西都要干净,要洗的很
干净,当然夹膜用的镊子更是要干净。[3]整个显色曝光都应该在暗室里呀。你放外面显色干什么
呀?这是一个连续的过程,没必要分开吧,感觉分开反而跟浪费时间呀。[4]具体问题具体分析。
显色的时间不是固定的,如果膜放到显色液里,荧光很强,迅速拿出,放到保鲜膜上,然后曝光就可
以了。如果膜放到显色液里,荧光很弱,可以多放一会,其实不用放很长时间也是可以的。可以把
膜放到保鲜膜上,因为保鲜膜上会粘有显色液的,在保鲜膜上照样可以进行显色反应的。如果膜很
亮〔就是说荧光很强,曝光时间可以很短的,如果荧光很弱或者看不到荧光,可以曝光很长时间的。
如果荧光很强,我会曝光最短的时间,也就是说,把曝光盒〔压片暗盒盖上然后用最快的速度打开
就可以了,如果荧光弱的话,我就用黑塑料袋把曝光盒装起来然后放入抽屉,去吃饭或者干其他事
情,回来继续显影定影,条带照样很清楚的,哈,有时候那是相当的清楚。[5]我把你的步骤改了一
下。供参考。1,封闭〔5%的脱脂奶粉 4 小时,室温下摇床上进行。〔说明:封闭是很重要的一步,
这步应该多话时间。一般来说,2 小时也可以的,但是 1 小时有些短了。2。此步删掉。3,孵育一
抗〔cell signaling,单克隆抗体,一抗用 5%的脱脂奶粉稀释,比例是 1:1000<说明书上标示>。
放在 4 度冰箱过夜。〔一抗孵育不是时间越长越好,应该适度,如果越长越好,那直接在室温或者
在 37 度放一夜不是更好。一抗用 5%的脱脂奶粉稀释效果远好于用 TBST 等稀释,这是我的亲身
经历。封闭过后不用洗脱。4,TBS/T 洗膜 3 次,每次 5 分钟,摇床上。〔可以不用滤纸吸,直接放入
二抗孵育。5,孵育二抗〔博士德,比例是 1:5000〔我用的说明书上的最大标示。室温摇床 1 小
时〔二抗 1 小时足够了。6,TBS/T 洗膜 3 次,每次 10 分钟。〔可以不用滤纸吸。7,加入 pierce 显
色试剂〔按说明书要求进行。8,曝光 5 分钟〔曝光时间可以按实际情况的不同而不同,显影〔至
今为出现目的条带,定影。〔把膜拿到暗室观察什么都没有,只有一些荧光液的残留痕迹,成隐约
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大片状,多出现于膜的边缘处,绝对不成条带状。
[6]本人在做一个 18KD 蛋白的 wb,转膜后预染 marker 各个条带都可见,不知道就是目的条带都
不能曝光出来。内参的 B-actin 条带清晰,背景也没有。想请教各位大侠:1.胞浆蛋白的提取是
不是有什么特殊要求。有什么提取方法比较好!2.18kd 蛋白的转膜甲醇的浓度是不是要比较高。
3.其他。。。希望能够有好的回答,最好能提供好的参考文献。谢谢!答:[1]你转膜后预染 marker
各个条带都可见,说明转膜没有问题。[2]感觉还是用试剂盒好一些。[3]可以适当减少电泳的时
间。[4]测过蛋白浓度吗?蛋白浓度是多少呀?如果蛋白浓度不是很高,上样量不是很大的话,可
以增加上样量,增加蛋白浓度。[5]增加一抗浓度,增加一抗孵育时间。[6]增加显色时间。[7]增
加曝光时间,可以曝光很长时间的。[8]当然是 0.2μm 的膜好一些,但是 18KD 的蛋白用 0.45 的膜
也可以的。注意转膜时间不要太长。
[7]请问有人做过 19KD 的蛋白吗?已经做了一段时间了,可是还是没有什么起色啊。现在跑胶倒
是已经可以了。但是转膜后染色看不到我要的条带啊。那条带在胶上就是很淡的,但是基本能看
到。可是转膜后就真的什么都看不到了似的。有没有什么办法可以成功将量少的蛋白条带转膜啊
〔可以肯定的说我的转膜条件没有将我所需要的条带转过。谢谢了。
答:[1]没有问题,继续往下做就可以了。[2]很多人都在考马斯兰染色的胶上或者在丽春红染色
的膜上找自己的目的条带,看到一个条带就说是自己的目的条带。其实真的是自己的目的条带的
可能性很小。组织蛋白或者细胞蛋白中含有很多种蛋白的,所以碰巧是目的蛋白的可能性是很小
的〔尽管从预染 MARKER 知道分子量是相近的。我们染胶或者染膜的目的并不是看自己的目的蛋
白是否在胶上或者是否转到了膜上。而是看胶上是否有蛋白,是否有比较清楚的蛋白条带。染膜
就是看蛋白是否转到了膜上。通过整体的蛋白的情况来推测自己的目的蛋白的情况。并不是非要
找出自己的目的蛋白。[3]要知道 ECL 的敏感性要比丽春红强很多的,也就是说比丽春红敏感很多
倍的,染色染不出的蛋白,显色或者曝光照样可以出条带的。[4]你的膜上都看到了蛋白,说明整体
上还是可以的,可以继续往下做。
[8].我做的 WB 最近两次看到荧光,但压片子总是白片,并且荧光时间很短!我快疯了!请高手
指点,谢谢!
答:能看到荧光,当时很快就消失了,可能主要是荧光淬灭的问题。很多情况都会导致荧光淬灭,
可能每个人的情况并不相同。如果胶片上没有条带,可以适当延长曝光时间。[1]用保鲜膜包好的
带荧光的膜,千万不要放到金属表面,碰到金属表面,荧光会迅速的淬灭。因为有些桌子是金属的,
所以放到上面会导致荧光迅速淬灭。这是亲身经历的。有些战友提到用镊子碰到膜会导致荧光淬
灭,可能是因为镊子是金属的缘故。[2]不注意的时候,把 ECL 的 A 和 B 混合了,以后再用,也会导
致荧光淬灭。各溶液使用后,请盖紧瓶盖,以防失效。特别是 B 液,含有氧化剂,比较容易被还原而
失效。[3]荧光可能对一些物质敏感,导致荧光淬灭。所以,尽量使和 PVDF/NC 膜接触的物品〔例
如保鲜膜、洗膜用的培养皿等都是干净的。我以前都是用保鲜包裹膜,然后曝光,但是保鲜膜太薄,
容易卷起来,我就用较厚的塑料袋,但是发现荧光一接触塑料袋就迅速淬灭,我估计可能是因为后
塑料袋上不干净,有些导致淬灭的物质。后来继续应用保鲜膜,就没有出现类似情况了。[4]夹膜
用的镊子一定要干净,每次用它夹膜之前,一般可以先在液体里〔比如应用中的 TBST 等液体过一
下〔洗一下,就是在液体里摇一下,镊子不干净很容易导致荧光淬灭的。[5]荧光淬灭和蛋白抗体
等也有原因。我以前就碰到过,我的是 5 个条带,发生淬灭的时候,有快有慢,不是 5 个条带一起淬
灭。尽管后来都淬灭了。所以,估计和蛋白抗体等也有关系,但可能并不是主要的原因。
[9]现需要将 28Ku 与 26Ku 的两种蛋白通过跑 SDS-PAGE 区分出来。换句话说,我使用什么样的
SDS-PAGE 条件能够使这两种蛋白的条带分开。比如用多大的胶浓度等.......请精通此道的高手
指点。谢谢!
答:[1]哈,不好意思,我把"分开"的意思理解错了。我的理解中的"分开"是,可以用两张小膜同时
转膜,然后 28Ku 与 26Ku 的两种蛋白分别转到这两张膜上。或者用一张膜转膜,然后能把这张膜剪
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开,两种分子两的膜分别到两张膜上。看来大家对"分开"的理解是两种蛋白能离开一定的距离就
可以了。哈,这样是当然的,不过如果不能达到我上面说的那种情况,这所谓的"分开"对实验有什
么意义吗?和分不开有什么区别吗?[2]哈,应该注意适度原则,"度"很重要,有些时候不是越大
越好,要注意适度。其实二十几的分子量用 10%、12%。15%的胶都可以的,把电压调到足够小,
效果都可以的。根本就没有必要用 18%的胶的。下面是不同分子量蛋白的适用胶的选择。[1]分
离胶的浓度和最佳分离范围:〔1SDS-PAGE 分离胶浓度 --- 最佳分离范围 〔KD>6%胶 ----
--------50-150 8%胶 ---- --------30-90 10%胶 ----------
--20-80 12%胶 ------------10-40 〔2 分离胶浓度〔% --- 线性分离范
围〔KD>15 ----- ------ --12-4310 ---- ---------16-687.5 --
----------36-945.0 ---- ------- -57-212[2]浓缩胶一般都是选 4%
或者 5%下面是 5%胶的配制方法:成分 ----- 配制不同体积 SDS-PAGE 浓缩胶所需各成分的体
积<毫升> 5%胶 - - 2 - - 3 - - 4 - - 6 - - 8 - - 10 蒸馏水 - - 1.4 - -
2.1 - - 2.7 - - 4.1 - - 5.5 - - 6.8 30%Acr-Bis<29:1> - - 0.33 - - 0.5 -
- 0.67 - - 1.0 - - 1.3 - - 1.7 1M Tris, pH8.8 - - 0.25 - - 0.38 - - 0.5
- - 0.75 - - 1.0 - - 1.25 10%SDS -- 0.02 -- 0.03 - - 0.04 -- 0.06 - -
0.08 - - 0.1 10%过硫酸铵 - - 0.02 -- 0.03 - - 0.04 - - 0.06 --- 0.08 -
- 0.1 TEMED - - 0.002 -- 0.003 -- 0.004 - - 0.006- - 0.008 - - 0.01[3]
哈,目标要明确,如果目标错了,就不好了。你的目的到底是什么?是分开蛋白吗?我想最后的目
标应该是曝光出条带吧。是吧?电泳时的蛋白什么样的分子量都有的,也有分子量之差小于 1 的,
有什么影响吗?抗体和目标蛋白结合,并不和与其相邻的蛋白结合,那么分开它有什么意义吗?
曝光的时候曝不出来就可以了〔只曝出目的蛋白。[4]而想把两者曝光曝出来,用我上面帖子中的
方法就可以了。
[10].刚开始做 western blot,走过两遍完整的过程,可是结果很奇怪,请各位老师指导分析。我
的目的蛋白分子量 42kd ,抗体都是 santa cruz 的,一抗 goat 抗 rat 多克隆,二抗驴抗羊-hrp,
蛋白 marker 是 fermentas sm0671 可视的那种,ecl 发光剂 不知道牌子的和 millipore 都有用。
分离胶是 12%的,照着分子克隆的我跑的两次,首先电泳时 marker 条带比正常的少,尤其似乎缺
了我要看的 40kd 左右的条带,而且条带很糊,越跑越谈。下面是膜上的 marker 条带,基本和胶上
是对应的,浓度也差不多。和说明书上应该出来的条带差别很大,缺很多条带,胶上主要缺 56kd
和 43kd 的条带,请问这是怎么回事?小的那块膜是我第一次做,用的是师兄流下来的试剂,大的
一张改用同学的试剂〔除了 30%双丙和 10%sds,结果也还是一样。问题:1。marker 缺条带,而
且很糊,越跑越淡,请问可能有哪些影响因素?2。又或者是不是 marker 有问题?原来怀疑 tris
-cl PH 的问题,测了一下,果然不大准,第二次就换了同学在用的,结果还是这样。ap 是现配
的,temed 新买的,胶凝的很不错。30%gel 有几个月了,一直放在 4 冰箱里,可能这个失效了?电
泳缓冲液是买的 10×的贮存液,基本是现配现用的。跑胶 30ma 恒流。marker 是新买的,和同学一
人一支,他跑 8%的胶,分子量 100 多的,跑的时候和我不一样,看不了条带。 答:[1]首先要注意
电泳液的问题,是否过期?是否配错了?
看左边的这张图,即使最下面还有条带,也会因为没有膜了,而显示不出来的。建议增加膜的长度。
[2]对比两张图,发现如果把右边的图放大到和左边的一样大,那么我们就会发现其实两张图相差
不多的。右边那张图的最下面一个条带已经很淡了,提示散开了,也就是说如果减少电泳时间的话,
下面的条带很有可能出来的。[3]其实制作 MARKER 的公司也是欠考虑的。如果红色条带下面的第
4 个条带也搞成红色的,那就好多了。[4]MARKER 公司说明中的图,是用一定浓度的胶配制的。不
同的浓度的胶会对 MARKER 产生影响的。即使同样浓度的胶,其他条件也很难完全相同,所
以,MARKER 和说明中有一定的区别是可以理解的。[5]注意如果胶配的不好,比如 PH 值,会对跑胶
有影响的。[6]小分子量的 MARKER,要早期观察,不要等胶跑了很久再观察。早期只要 MARKER 条
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