细胞培养步骤(2).docx
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2022-06-04
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实验步骤：
细胞复苏：
1.提前准备好，37 摄氏度水浴完全培养基（即 DMEM+10%胎牛血清+1%双抗）。
2.先取 9ml 的完全培养基，置于无菌的 15ml 离心管中。
3.快速从液氮罐中取出 MCF-7 细胞，与 37 摄氏度水浴，至冻存管中还剩一小块冰时，置入
无菌工作台。
4.将 1ml 细胞液移入含有 9ml 培养基的 15ml 离心管中，1000r/min，5min，弃上清，（去除
DMSO 对细胞的影响）
5.加入新鲜培养基 10ml，轻轻混匀，移入 10cm 的 dish 中。
6.隔天更换培养基。
细胞传代：
1.提前准备好，37 摄氏度水浴完全培养基（即 DMEM+10%(或 15%）胎牛血清+1%双抗），
1*PBS 缓冲液，0.25%的胰酶，当细胞长满至 80%左右即可传代。
2.弃去原培养液，加入 2ml（6cm 的培养皿）1*PBS（无菌），按“8”字型摇动，重复洗 2-3
遍。
3.加入 500ul（大皿加 1.5ml）的胰酶消化，使其均匀分布在皿底，细胞表面可见覆盖薄薄
的一层液体就行。室温下消化，用显微镜观察到，细胞皱缩变圆，发亮，有脱离的迹象，
即可吸去胰酶液(大皿也可直接加入 8.5ml 完全培养基终止消化）等待一会，使残余的酶液
在消化一小段时间后，加入 2ml 完全培养基。终止消化。
4.轻轻吹打，是细胞脱落下来，混匀，显微镜下观察最好为单细胞悬液。
5.以一传二的方式，传代。在新培养皿中再加入 3ml 培养基，轻轻混匀。置入 37 度，
5%CO2，培养箱。
6.隔天，细胞贴壁后，弃去旧培养基，PBS 洗两遍，加入新的培养基 4ml。
7.每天观察细胞生长状态。
细胞冻存
1.提前准备好冻存液与 4 摄氏度预冷，MCF-7 冻存液为 90%血清+10%DMSO。
2.像细胞传代一样，将贴壁细胞制成单细胞悬液，离心，1000r/min，5min，去上清，加入
5mlPBS 溶液，吹匀，离心，1000r/min,5min,弃上清。
3.加入 2ml 预冷的冻存液，吹匀，移至冻存管中，每管 1ml，（此处用的是 10cm 的
dish）。
梯度降温，-20 摄氏度，半小时。-70 摄氏度过夜。最后移至液氮中。
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