开发技术-硬件-βB2晶体蛋白基因敲除可引起白内障并降低C57BLC小鼠生殖功能.zip资源-CSDN文库

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开发技术-硬件-βB2晶体蛋白基因敲除可引起白内障并降低C57BLC小鼠生殖功能.zip （1个子文件）

βB2晶体蛋白基因敲除可引起白内障并降低C57BLC小鼠生殖功能.pdf 3.63MB

目

录

..................... .............................................................................

英文摘要

......................................................

英文缩写表

....................................................

前

言

......................................................

•

■

第一部分

pB?

晶体蛋白基因敲除

C57BL/C

小鼠模型的建立及鉴定

动物模型的建立

.......... ............. ..........

模型鉴定

..........................................

结果

...............................................

讨论

.............................................

第二部分卩

晶体蛋白基因敲除可引起

C57BL/C

小鼠白内障

…

材料和方法

......................................

结果

.......... ................. ..............

讨论

.............................................

第三部分

pB2

晶体蛋白基因敲除可降低

C57BL/C

小鼠生殖功能

材料和方法

......................................

结果

.............................................

讨论

.............................................

全文小结

. ...... ...........................................

主要研究结果

................... ................

主要创新点

.......................................

存在不足

........................................

进一步研究方向

.................................

参考文献

............................

综述一

...........................

综

述二

...........................

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢

.................................

・

PB2

晶体蛋白基因敲除可引起白内障并降低

C57BL/C

小鼠生殖功能

PB2

晶体蛋白基因敲除可引起白内障并降低

C57BL/C

小鼠生殖功能

摘要

晶状体中的蛋白质主要包括晶体蛋白

(

crystallins)

、

膜蛋白

(

membrane

Protein)

和细胞骨架蛋白

(cytosteletal

protein)

等

。

按水溶性与否可分为可溶性

蛋白(晶体蛋白)

、

非可溶性蛋白(膜蛋白

、

细胞骨架蛋白

、

聚合的晶体蛋白)

。

人晶状体内

90%

的可溶性蛋白是晶体蛋白

：

分别是

(

、

卩和

晶体蛋白

。

目前对

•晶体蛋白的功能研究比较广泛

，

它的分子伴侣作用已得到世界公

认

。

对卩•晶体蛋白的研究还比较少

，

其中阳

晶体蛋白

(PB2

crystallin,

Crybb2)

在

族晶体蛋白中含量最高

，

而且它的水溶性成分呈年龄依赖性增高

，

因此

，

它

的正常结构及其水溶性成分水平

，

对维持晶状体的高折射系数和透明至关重要

。

这种反常性增高势必包含了它在维持晶状体透光性中的重要作用

，

因此它的功能

值得进一步研究

。

基因敲除是研究蛋白功能的一个重要手段

，

已有研究证明-晶体蛋白基因敲

除可以导致白内障

，

而且

或

■晶体蛋白基因突变也可以导致白内障

。

文献报道

Crybb2

基因突变可降低生殖功能

。

目前国内外尚未有

Crybb2

基因敲除动物模型

的报道

，

因此我们选择此蛋白作为靶点

，

利用

Crybb2

基因敲除小鼠模型

，

来研

究该蛋白在维持晶状体透明性中的作用和其晶状体外生物学功能

。

本文主要通过观察

Crybb2

基因敲除对小鼠晶状体结构的影响及其在晶状体

内和晶状体外组织的定位

，

分析该蛋白在维持晶状体透明性中的作用并研究其晶

状体外功能

。

主要方法:

Crybb2

基因敲除小鼠模型的建立及鉴定

此部分工作是应第二军医大学第一附属医院中心实验室要求

，

与美国纽约

iGTL

实验室合作并最终在美国

iGTL

实验室完成

，

最后以馈赠方式供我们研究

专用

。

小鼠品系为

C57BL/C

小鼠

，

小鼠模型为

只杂合子

，

已成功进行繁殖超

过

代

，

子代小鼠生长发育状况良好

。

取鼠尾末端组织

，

通过

PCR

技术对小鼠基因型进行鉴定

；

取小鼠眼晶状体

第一军医大学博七学位论文

进行匀浆离心后取上清液

，

通过

Western

blot

技术对晶体蛋白的表达进行鉴定

。

鉴定后将小鼠分类饲养繁殖

。

Crybb2

基因敲除小鼠晶状体结构特征

用暗视野显微镜观察经氧化损伤后晶状体体外培养的混浊程度

。

染色观

察晶状体囊膜下皮质的厚度随年龄的变化

，

并与野生型同品系小鼠对比

。

免疫组

织化学研究其在晶状体内的定位

。

Ciybb2

基因敲除小鼠晶状体外功能研究

图形视网膜电图

(

pattern

electroretinogram,

P-ERG)

研究

Crybb2

基因敲除后

视觉电生理的改变

。

Western

Blot,

PCR

和免疫组织化学方法检测

Crybb2

mRNA,

Crybb2

在晶状体外阳性表达(视网膜

、

大脑

、

脊髓

、

睾丸

、

卵巢)

，

尽管是低水平

表达

。

数小鼠产仔数

，

精子计数

，

睾丸称重

，

大体形态和

染色观察形态学改

变研究

Crybb2

基因敲除后小鼠生殖功能的改变

，

并与野生型同品系小鼠对比

。

实验结果

：

Crybb2

基因敲除小鼠模型建立后

，

经

Western

blot

鉴定

，

纯合小鼠晶体蛋白

未检测到

Crybb2

的表达

，

杂合及野生型小鼠晶体蛋白在分子量

23KD

处检测到

该蛋白的表达

。

Crybb2

基因敲除导致小鼠白内障的发生

，

白内障均发生在前或后皮质部

，

最

早发生于出生后

周左右

。

Crybb2

定位于晶状体皮质囊膜下

，

基因敲除后

，

晶

状体抗氧化能力下降

，

随年龄增加

，

皮质变薄

。

P.ERG

检查发现

Crybb2

基因敲除小鼠振幅降低

。

野生型小鼠视网膜

，

大脑,

脊髓

，

睾丸

，

卵巢中可检测到

Crybb2mRNA,

Crybb2

阳性表达

。

Ciybb2

基因敲

除后

，

精子活力下降

，

计数减少

，

小鼠睾丸和卵巢外观减小

，

睾丸重量减轻

。

小

鼠生仔数目轻度减少

，

窝数减少

。

结论

：

Crybb2

基因敲除可以导致

C57BL/C

小鼠白内障的发生

，

为皮质性白内障

，

皮

质混浊程度随年龄增加而增加

，

皮质厚度随年龄的增加而变薄

。

Crybb2

基因敲除可以降低

C57BL/C

小鼠生殖功能

。

关键词

：

Crybb2,

基因敲除

，

白内障

，

生殖功能降低

PB2

晶体蛋白基因敲除可引起白内障并降低

C57BL/C

小鼠生殖功能

Targeted

knockout

pBl-crystallin

gene

the

C57BL/C

mice

induces

cataract

and

subfertility

ABSTRACT

Crystallins

membrane

protein

and

cytosteletal

protein

are

the

main

compositon

proteins

the

len.

Crystallins

water-soluble,

but

cytosteletal

protein

and

membrane

protein

and

polymerized

crystallins

are

urea-soluble.

90%

the

water-soluble

proteins

the

heman

eye

lens

are

the

crystallins:

、

（

and

crystallin.

The

study

the

function

a-crystallin

widespread

and

the

molecular

chaperone

was

generally

accepted.

But

the

study

p-crystallin

ralatively

less.

The

concentration

pB2-crystallin

not

only

higher

than

other

p-crystallin

but

also

increase

with

age.

the

function

deserved

research.

Crystallin

gene

knockout

important

method

study

the

function

crystallin.

Some

research

have

find

that

the

a-crystallin

gene

knockout

can

lead

cataract,

the

p-crystallin

gene

mutation.

has

not

been

reported

the

animal

model

卩

B2-crystallin

gene

knock

out

all

over

the

world.

chose

the

crystallin

the

target

and

set

the

animal

model

research

its

function

maintaining

the

transparency

lens

and

its

extralenticular

functions.

our

study,

pattern

electroretinogram

was

used

study

the

function

retinal

ganglion

cell

after

the

gene

knock

out.

The

lens

pB2-crystallin

gene

knockout

mice

was

studied

this

article.

examined

the

vitro

construction

len

and

analysis

the

function

pB2-crystallin

keeping

transparency

the

lens

and

observed

influence

reproduction

the

mouse

with

targeted

knockout

the

mouse

pB2-crystallin

gene

compared

with

the

wild

tipe.

Methods:

Generation

and

verification

pB2-crystallin

gene

knockout

mice.

PB2-crystallin

gene

knockout

mice

were

produced

the

Genious

Targeting

Laboratory.

The

model

mice

were

heterozygote

which

have

been

breed

the

central

lab

and

have

reproduced

over

generations.

Gene

expression

were

characterized

PCR

and

western

blot.

第二军医大学博士学位论文

The

structure

and

character

lens

pB2-crystallin

gene

knockout

mice

Fresh

lens

Irom

8-week-old

gene

knockout

and

wild

type

mice

were

removed

from

the

eyeballs

and

cultured

TC-199

medium

for

hours

CO2

incubator,

and

then

the

gene

knockout

mice

were

screened

for

the

degree

opacity

with

dark

field

biomicroscopy.

Microstructure

lens

was

analyzed

hematoxylin

and

eosin

stain

and

immunohistochemistry.

studying

cortex

different

age

pB2-crystaIIin

gene

knockout

mice

lens,

observed

the

influence

development

cataract.

Fertility

were

studied

using

knock

out

pB2-crystallin

mice

and

the

wild

type

Pattern

electroretinogram

was

used

study

the

function

retinal

ganglion

cell

after

the

gene

knock

out.

used

Western

Blot,

PCR

and

immunohistochemistry

detect

mRNA

pB2-crystallin

gene,

pB2-crystaIlin

outside

the

len

(retina,

brain,

spinal

cord,

ovary

and

testis)

although

was

expressed

lower

levels

several

extralenticular

locations.

Through

the

babies

the

mouse

cipher,

Sperm

count,

testis

weigh,

using

morphshape

and

hematoxylin

and

eosin

stain

observation

method,

studied

the

reproduction

function

the

mice

targeted

knockout

the

mouse

pB2-crystallin

gene

compared

with

the

wild

tipe.

RESULTS

：

・

Western

blot

failed

detect

any

卩

B2-crystallin

the

lens

卩

B2-crystaIIin

gene

knockout

mice.

The

gene

knockout

mice

were

screened

severe

opacity

with

dark

field

biomicroscopy.

Hematoxylin

and

eosin

stain

and

immunohistochemistry

found

that

the

卩

B2-crystallin

was

located

subcapsular

the

cortex

and

the

cortex

was

thiner

the

gene

knockout

mice

with

ageing.

The

vibration

the

Pattern

electroretinogram

was

lower

after

gene

knock

out.

Through

the

mice

the

baby

cipher,

Sperm

count,

testis

weigh,

found

that

the

productivity

were

lower

the

gene

knock

mice.

Using

morphshape

and

hematoxylin

and

eosin

stain,

observed

smiler

shape

and

structure

chaos

the

mice

with

targeted

knockout

the

pB2-crystaUin

gene

compared

with

the

wild

tipe.

Conclusions

：

legated

knockout

the

mouse

卩

B2-crystanin

gene

can

induce

cataract

which

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