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western-blot-全过程-详细步骤.doc
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一:提蛋白:
1. PBS 洗 2 遍,加 RIPA 80-100ul(含 10xcooktail)。
2. 在冰上刮到离心管中,在冰上裂解 20-30min。
3. 4 度离心,13000rpm、10-15min(准备新的离心管、配 BCA 200ul/每孔(A:B=50:1)、96 孔板加 PBS(2 个对照组
20ul,实验组 18ul))。
4. 取上清转移到新离心管中,记住转移的体积。
5. 96 孔板中每孔加 2ul 蛋白液。
6. 每孔加 200ulA/B 混合液。
7. 37 度半小时。
8. 测浓度以及标化用一起 在 libo 文件夹找模板,最后得到每组需要加的 RIPA 以及 loding buffer,还有标化后的浓度。
562 波长 0.046 斜率 (实验组值-对照组值)/斜率=浓度 浓度最好在 4-8ug/ul 最好,跑胶时就可以只加 10ul 蛋白
液(蛋白含量 40-80ug)
9. 加好对应的 RIPA 以及 loding buffer 后,煮蛋白 5-15min,-20 度保存。
二:跑胶
1. 1.0 玻板,洗干净
2. 配制 10%或者 12%分离胶 一块胶需要 5ml
3. 灌分离胶,在分离胶上层灌无水乙醇
4. 配制 5%浓缩胶 2 块胶需要 4ml
5. 待分离胶干后,灌浓缩胶,插梳子
6. 待胶干后,将胶及玻板一起放入电泳槽,拔梳子,倒入 1*running buffer(上腔灌满,下腔过电线丝)
7. 预电泳,100v,10-15min
8. 加样(蛋白样品及 marker)10ul,marker 5ul
9. 60v 10-20min,之后 100-110v
三:转膜
1. 配 transfer buffer ,用 10*transfer buffer 稀释 10 倍,并加 20%甲醇
2. transfer buffer 浸泡海绵、滤纸
3. pvdf 膜,甲醇泡 1 分钟,清水洗 2 次,泡在 transfer buffer 里 20min
4. 胶取出,在 transfer buffer 里泡 10min
5. 黑胶白膜(一层海绵,2 层滤纸)
6. 转膜 100v,1—1.5h(黑对黑,冰板,在冰里跑)
四:封闭、一抗、二抗
1.5%脱脂奶粉(pbst 溶)1h 37 度
2.一抗 4 度 12h
3.pbst 洗膜,3 次,每次 10min
4.二抗(1:5000)1h 37 度
5. pbst 洗膜,3 次,每次 10min
6.显影剂 A 和 B 各 300ul
PBST:1000ml’PBS+1mltween
5%脱脂奶粉:100mlPBST+5g 脱脂奶粉
10*running buffer:tris 30.3g 甘氨酸 144.1g sds 10g 加水至 1000ml
10*transfer buffer:tris 30.3g 甘氨酸 144.1g 加水至 1000ml
1* transfer buffer:100ml10*transfer buffer 200ml 甲醇 加水至 1000ml
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