总 RNA 的电泳检测.doc
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【总 RNA 电泳检测详解】 总 RNA 的电泳检测是一种常见的生物实验技术,用于评估 RNA 的纯度、完整性以及质量。在这个过程中,RNA 样品通过凝胶电泳进行分离,通过观察电泳结果来判断 RNA 的状态。以下是电泳检测的一些关键点: 1. **指示剂选择**:通常使用溴酚蓝和二甲苯氰作为指示剂,它们在电泳过程中形成明显的颜色带,帮助定位 RNA 分子的位置。 2. **胶浓度**:胶浓度通常设定在1-1.2%,适合 RNA 的分离。 3. **电泳条件**:电压的选择取决于实验时间安排,当溴酚蓝移动到2-3cm时停止电泳,然后在紫外线下观察结果。 4. **关键观察点**: - **上样量**:过量的 RNA 会导致亮带,可能掩盖实际信息,需要减少上样量重跑。 - **小片段 RNA**(如5S rRNA):虽然小片段RNA可能会被去除,但如果过于明亮,可能提示上样过量。 - **大片段 rRNA**(28S/18S):清晰的条带表示完整性良好,比例异常或弥散可能表明完整性差。 - **基因组 DNA**(gDNA)残留:在23kb处的条带指示 gDNA 的残留量,过多残留可能与提取方法或样本处理有关。 - **加样孔**:加样孔的亮度显示可能的杂质残留,如蛋白质、多糖或多酚。 5. **问题分析**: - **比例失衡**:28S/18S的比例不一定是2:1,关键看条带是否清晰。 - **多条带**:不一定是问题,可能是物种特异性或RNA二级结构的影响。 - **条带缺失或弥散**:可能提示RNA降解,若伴随向上弥散,可能涉及电泳问题或盐残留。 - **亮团**:通常与上样过量关联,应减少上样量重试。 - **DNA Marker 对照**:DNA Marker的大小对比并不完全准确,应更关注1kb左右的条带,可能表示RNA或凋亡DNA Ladder。 6. **DNase I 处理**:不使用DNase I时,总RNA会残留gDNA,其量与提取方法和样本量相关。 7. **杂质残留**:非蛋白质/非核酸类杂质残留可能与样本类型和提取方法有关,而蛋白质和核酸同步残留可能与样本处理不当有关。 在分析电泳图谱时,宏观上要评估整个批次的抽提效果,以便确定问题是普遍还是特定于某些样本。微观分析时,应关注上述提到的关键位置,结合样品处理过程和方法,做出准确的判断。通过这种方法,我们可以确保得到高质量的RNA,为后续实验(如转录组测序、RT-PCR等)提供可靠的基础。
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