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1RNAseq质量控制.docx
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2022-07-13
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RNA-seq 质量控制
1 建库流程
1.1 Total RNA 样品检测
1.1.1 琼脂糖凝胶电泳分析 RNA 降解程度以及是否有污染
一句话总结:琼脂检测主要观察 28s 和 18s。判断 RNA 好坏的标准是28s,18s 是否清晰,尤其是 28S
亮度比 18s 亮度大
28s,主要是剪切前的前体 RNA,主要包括不均一核 RNA(未剪切成熟的 mRNA 前体)和主要是 28s,
18s,5s 的前体转录子。前体存在于细胞核(然后加工剪切成 28s,18s,5s 和成熟的小片段的 mRNA。
这些成熟的 RNA 进入到胞浆。有功能的 mRNA 是存在于胞浆中的成熟的 mRNA,前体 mRNA 是没有
翻译功能的(蛋白质翻译机器,核单倍体是位于胞浆中的)。真正成熟的 mRNA,主要集中在 28s 和 18s
之间的荧光背景(一般每条基因 mRNA 量很少,所以,整体一般看不到明显带).如果 28s 只是比 18s 稍
高,或者亮度差不多,即使条带清晰,也已经提示部分降解了。大片段开始降解,从 28s 降解到 18s 最
后降解到 5s。这样降解过程中,28s 减少,18s 增多,28s:18s 比例就会下降。如果最容易降解的 28s
都没有降解,(从比例推断),那么更难降解的 mRNA,就推理出肯定是完好的了。
泳道:
1 2 3 4 5 6 7 8 9
这张图片就是一个离心柱子提取 RNA 的不同降解情况的典型例子。
泳道 1,5,6,7,8,9 部分降解了,所以 28s 是首先降解,28s 条带变淡,而部分降解首先是降解成较小的 18s
左右的片段,所以 18s 条带明显变粗,造成 28s:18s 的比例竟然小于 1 了。然后在不该看到条带或者应
该是很弱的 5s 位置,出现了较明显的 5s 大小的降解带。
3,4 是完全降解了,28s,18s 已经基本降解光了。两条带都看不见了。最后降解成的小片段正好和 5s 大
小一致,所以在 5s 位置看到了大量的一条浓浓的降解小片段,和 5s 一样大小。
2 就是完全正常提取的 RNA,大家可以看到 28s:18s 比例大约是 2:1,5s 位置也基本见不到带。这就说明完
全正常,无降解。
(2) Nanodrop 检测 RNA 的纯度(OD260/280 比值)
一句话总结:260/280 大约在 2.0 而 260/230 ration 在 2.0-2.2.
OD260 代表核酸的吸光度,OD280 代表蛋白质的吸光度。280、320、230、260nm 下的吸光度分别代
表了核酸、背景(溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白等有机物的值。A230 测定其它碳源物质,如酚,糖类
等;A260 是核酸的吸收峰测 RNA 和 DNA,引物等的浓度用的;A280 是蛋白质的吸收峰。
一般的,我们只看 OD260/OD280(Ratio,R)——1.8~2.0 时,我们认为 RNA 中蛋白或者时其他有
机物的污染是可以容忍的,不过要注意,当用 Tris 作为缓冲液检测吸光度时,R 值可能会大于 2(一般
应该是<2.2 的)。当 R<1.8 时,溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显,你可以根据自己的需要决
定这份 RNA 的命运。当 R>2.2 时,说明 RNA 已经水解成单核酸了。 纯 RNA 的 A260/A280 的比值
为 2.0。
OD260/OD230 的比值还表明 RNA 的纯度——其值 <2.0 表明裂解液中有亚硫氰胍和β-巰基乙醇残
留,其值 >2.4,需用乙酸盐,乙醇沉淀 RNA。
(3) Qubit 对 RNA 浓度进行精确定量
一句话总结:RNA-seq 测序需要至少 300 ng 总 RNA
(4) Agilent 2100 精确检测 RNA 的完整性
一句话总结:2100 RIN 值高好,样品间 RIN 值相差 1-1.5 最好。
Agilent 2100 对文库的 insert size 进行检测,RIN 值反应的是样品的降解。RIN=RNA integrity
number,即 RNA 分子完整数,从 0-10,直接反应了 RNA 质量的好坏,此数值越大表明 RNA 质量
越好越完整。
1.2 建库流程
1.2.1 ssRNA-seq 建库(针对长非编码 RNA 分析)
RNA 检测合格后,通过 epicentre Ribo-Zero
TM
试剂盒去除 rRNA(可以拿到非 polyA 的转录本)随后
加入 fragmentation buffer 将 RNA 打断成 150-200bp 短片段 150-200bp,以短片段 RNA 为模板,用
六碱基随机引物(random hexamers)合成一链 cDNA,然后加入缓冲液、dNTPs(dUTP、dATP、
dGTP 和 dCTP)和 DNA polymerase I 合成二链 cDNA,随后利用 AMPure XP beads 纯化双链
cDNA。纯化的双链 cDNA 再进行末端修复、加 A 尾并连接测序接头,然后用 AMPure XP beads 进行
片段大小选择。之后用 USER 酶降解含有 U 的 cDNA 第二链,最后进行 PCR 富集得到链特异性 cDNA
文库。
图:lncRNA 建库
1.2.2 小 RNA 建库
样品检测合格后,使用 Small RNA Sample Pre Kit 构建文库,利用 Small RNA 的 3’ 及 5’
端特殊结构( 5’ 端有完整的磷酸基团, 3’ 端有羟基),以 total RNA 为起始样品,直接将 Small
RNA 两端加上接头,然后反转录合成 cDNA 。随后经过 PCR 扩增, PAGE 胶电泳分离目标 DNA
片段,切胶回收得到的即为 cDNA 文库。
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资源评论
- 王景8652023-08-30这个资源总结的也太全面了吧,内容详实,对我帮助很大。
chenlu0528
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