液相色谱仪进行高效液相色谱分析的实验技术.doc
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2019-09-05
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液相色谱仪进行高效液相色谱分析的实验技术
当使用液相色谱仪进行高效液相色谱分析时，除了解高效液相色谱法的基本理论外，
还应掌握必需的实验技术，这样才能获得理想的分离效果。
在高效液相色谱分析中，当色谱柱的选择确定后，应采用适合组成的流动相进行实验，
在实验过程准确控制流动相的流量，防止微米数量级机械杂质阻塞流路，保持较低的柱压
力降是实验操作中的关键。为此，色谱工作者应当掌握以下的实验技术： 溶剂的纯化技术。
在高效液相色谱分析中，正相色谱以己烷作为流动相主体，二氯甲烷、氯仿、乙醚作为
改性剂；反相色谱以水作为流动相主体，以甲醇、乙腈、四氢呋喃作为改性剂。通常使用
分析纯、优级纯试剂，可以满足高效液相色谱分析的要求，但为了防止微粒杂质堵塞流路
或柱入口垫片，流动相都需要用 G4 微孔玻璃漏斗过滤，或用 0.45μm 的微孔滤膜过滤后
再使用。
色谱柱的填充技术
填充色谱柱的方法，根据固定相微粒的大小有干法和湿法两种。微粒大于 20μm 的可
用干法填充，要边填充边敲打和振动，要填得均匀扎实。直径 10μm 以下的柱，不能用干
法填充，必须采用湿法。
色谱柱的保护与再生技术
高效液相色谱柱填充了高效全多孔球形微粒固定相，并用高压匀浆法填充，其售价较
贵，若使用不当，会出现柱理论塔板数下降、色谱峰形变坏、柱压力降增大、保留时间改
变等不良现象，从而大大缩短色谱柱的使用寿命。
梯度洗脱技术
在 HPLC 分析中，梯度洗脱功能相似于气相色谱分析中的程序升温，它对改善色谱分
离效果，增加峰容量，可发挥重要的作用。
色谱柱前和柱后的衍生化检测技术
当前在高效液相色谱法，最常用的高灵敏度检测器是荧光检测器和紫外检测器，但它
们只能检测有紫外吸收或在紫外光照射下产生荧光的、具有特定化学结构的化合物。
为了使在这些检测器上响应值很小的化合物也能被检测出来，通过与衍生化试剂反应，
使胺、氨基酸、羧酸、醇、醛、酮等有机物生成可吸收紫外光或产生荧光的化合物。
样品的预处理技术
对组成复杂的样品或受外界条件（日光照射、受热、电磁辐射、氧化等）作用而发生
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